Tổng quan

Sốt rét hiện nay vẫn là một trong các vấn đề y tế công cộng đầy thách thức trên toàn thế giới, và khu vực Đông Nam Á của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có tỷ lệ mắc sốt rét cao thứ hai với tổng cộng 7,9 triệu ca trong năm 2018[1]. Mặc dù trong hai thập kỷ qua số lượng ca mắc và tử vongđược báo cáo đã giảm đáng kể [2], thì tỷ lệ nhiễm sốt rét tại các tỉnh miền trung và phía nam vẫn còn cao, đặc biệt là các tỉnh giáp ranh với Lào và Cam-pu-chia [3].Mặc dù 40 trong số 63 tỉnh thành của Việt Nam đã được công bốkhông còn sốt rét, vẫn còn một vài tỉnh thành có số ca bệnh chiếm một phần ba tổng số ca của cả nước mỗi năm[3], và thêm 1600 ca bệnh ngoại lai – một hiện tượng được ghi nhận lần đầu vào năm 2018, góp phần làm cho gánh nặng sốt rét càng trở nên khó khăn hơn[1].

Tại Việt Nam, Plasmodium falciparum (64%) và Plasmodium vivax (35%) là những ký sinh trùng sốt rét có tầm ảnh hưởng nhất. Liệu pháp kết hợp các thuốc có gốc Artemisinin (ACT), đặc biệt là dihydroartemisinin piperaquine (DHA-PPQ), chính là biện pháp điều trị tuyến đầu [1]. Một trong số các trở ngạichính gây khó khăn cho công tác phòng chống sốt rét là khả năng kháng thuốc artemisinin của ký sinh trùng [4], hay vốn đã được định nghĩa là sự chậm làm sạch ký sinh trùng [5, 6]. Tình trạng kháng artemisinin cũng được ghi nhận khá nhiều ở Việt Nam,Tây Cam-pu-chia và biên giói Thái Lan-Myanmar [7]. Chính vì một phần không nhỏ dân số Việt nam sống ở các vùng sốt rét lưu hành, nơi các kiểu hình kháng thuốc đã được báo cáo, thì các nghiên cứu giúp giải mã sự đa dạng di truyền và giá trị nhiễm đa alen (multiplicity of infections-MOI) của P.falciparum là điều thiết yếu đề nắm bắt được cường độ lan truyền, các kiểu dịch tễ và độc lực của các loài ký sinh trùng này, và đặc biệt là nhằm đánh giá các biện pháp nhắm đến phòng chống sốt rét [8,9,10,11].

Sự đa dạngdi truyền của P.falciparum thường được xác định bằng việc đánh giá phạm vi tính đa hìnhcủa các protein bề mặt merozoite msp1 và msp2, chúng được tìm thấy trên bề mặt các merozoite trong giai đoạn nội hồng cầu của vòng đời P.falciparum [12, 13]. Gen msp1 trênnhiễm sắc thể số 9 bao gồm 17 đoạn khác nhau, và đoạn 2 có tính đa hình caovà bao gồm 3 họ alen khác nhau: MAD20, K1 và RO33. Gen msp2 trên nhiễm sắc thể số 2 bao gồm các đoạn trình tự lặplại ở giữacó tính đa hình cao tại đoạn 3 và bao gồm hai họ alen có thể phân biệt được là 3D7 và FC27. Cả hai gen msp1 và msp2 có tính sinh miễn dịch (immunogenic) cao và được xem là các ứng cử viên vắc-xin tiềm năng giai đoạn nhiễm bệnh trong máu [14, 15]. Cả hai chỉ điểm di truyền này thường được sử dụng để chỉ ra số lượng chủng ký sinh trùng xuất hiện trong cùng một vật chủ, điều này rất có ích trong việc phân biệt giữa tái phát hay tái nhiễm trong các nghiên cứu hiệu lực thuốc [16]. Khả năng tạo thành dòng(clonality) của căn bệnhlà số lượng các dòng/chủng/kiểu gen riêng biệt trên mỗi bản phân lập (đối tượng nhiễm bệnh). Nhiều hơn một dòng/kiểu gen đồng nghĩa với polyclonality (có nguồn gốc từ nhiều dòng khác nhau). Do đó, số trung bình của các kiểu gen hoặc các dòngtrên mỗi đối tượng nhiễm bệnh (bản phân lập) được định nghĩa là “nhiễm đa alen“(MOI). Giá trị MOI cao cho thấy rằng một vật chủ mang nhiều chủng ký sinh trùng và có liên quan đến khả năng kháng thuốc của of P.falciparum với sự lan truyền ký sinh trùng quá mức tại các khu vực bệnh lưu hành rất cao (holoendemic areas) [16] .

Tại Việt Nam, các alen msp1 và msp2 phổ biến nhất trong năm 2012 [17] lần lượt là MAD20 [18] và 3D7 [19]. Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định sự phân bố các loài Plasmodium và sau đó là các kiểu gen msp1, msp2 khác nhau và ước lượng giá trị MOI trong các bản phâm lập lâm sàng từ các khu vực bệnh sốt rét lưu hành tại Việt Nam.

Khu vực nghiên cứu và thu thập mẫu

Tất cả người tham gia đã đồng ý và ký vào đơn tự nguyện tham gia. Nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Hội đồng Y đức Học viện Quân y Việt Nam, Hà Nội, Việt Nam. Nghiên cứu này đã thu thập 222 bản phân lập lâm sàng từ những người lớn nhiễm sốt rét chưa biến chứng (tuổi trung bình = 29,1 ± 9,5; 88% nữ giới). Người tham gia biểu hiện các triệu chứng sốt rét và có kết quả xét nghiệm ký sinh trùng dương tính (kính hiển vi hoặc RDT) nhưng không có các biểu hiện của sốt rét ác tính được định nghĩa là nhiễm sốt rét chưa biến chứng. Các bản phân lập lâm sàng đã được thu thập từ các tỉnh thành của Việt Nam, bao gồm: Đăk Lăk, Gia Lai và Đăk Nông trong giai đoạn năm 2017–2019. Ba tỉnh này (Đăk Lăk, Gia Lai và Đăk Nông) giáp ranh với nhau và là các tỉnh thuộc vùng trung Tây Nguyên có biên giới với Cam-pu-chia.Các mẫu máu toàn phần cũng được thu thập từ các đối tượng và được xác nhậnsự có mặt ký sinh trùng Plasmodium bằng kính hiển vi. Các mẫu máu được bảo quản ở − 20 °C cho đến khi được sử dụng về sau.

Định loại loài Plasmodium bằng biện pháp real-time PCR lồng

DNA hệ gen đã được phân lập từ 50 µl máu toàn phần bằng bộ Mini-Kit QIAamp DNA (Qiagen, Hilden, Đức) tuân thủ các quy trình của nhà sản xuất. Để phát hiện và mô tả các loài Plasmodium, chúng tôi đã sử dụngreal-time PCR Pan-Plasmodium probe-based Taqman, như đã mô tả ở trước đó [20].

Nói một cách ngắn gọn, DNA ký sinh trùng đã được khuếch đại bằng một biện pháp PCR thông thường sử dụng các mồi primers PLU5 và PLU6 [21]. Các amplicons từ khâuPCR trênđã được sử dụng như là các DNA mẫu (templates) trong một phép phân tích real-time PCR lồng single-plex để phân biệt các loài Plasmodium. Trong mỗi phân tíchreal-time PCR lồng single-plex, các mồi riêng biệt dành cho P.falciparum [22], P.vivax [23], Plasmodium malariae, Plasmodium ovale curtisi, Plasmodium ovale wallikeri [20] được sử dụngtương ứng (Table 1). Các phép phân tích này được thực hiện bằng bộ kit SensiFAST™ Probe No-ROX (Bioline, Tennessee, USA) trong một hệ thốngLightCycler 480 Instrument II (Roche, Basel, Thụy Sĩ). Mỗi bản phân lập lâm sàng đã được chạy với các bản sao. Sự thành công của quá trình khuếch đại được định nghĩa bằng các giá trị Ct lần lượt nhỏ hơn hoặc tương đương với 40. Tất cả các phân tích này đều bao gồm một khâu chứng âm NTC (non-template control) và chứng dương. Các giá trị Ct đã được tính toán theo mặc định bằng việc sử dụng biện pháp tối đa đạo hàm cấp hai (second derivative maximum method) được tích hợp trong phần mềm LightCycler 480 (phiên bản 1.5.1.62).

Bảng 1 Danh sách các mồi được sử dụng định loại loài plasmodium bằng biện pháp real-time PCR lồng

Xác định kiểu gen msp1 và msp2 Plasmodium falciparum

Các mẫu dương tính P. falciparum đã được xác định kiểu gen bằng biện pháp PCR lồng. Phân tích PCR vòng ngoài đã được sử dụng để khuếch đại các vùng gen bảo tồn của msp1 và msp2 và sau đó phân tích PCR lồng đã được sử dụng để khuếch đại các họ alenMAD20, K1 và RO33 tại locus gen msp1 và họ alen 3D7 và FC27 tại locus gen msp2. Các phân tích PCR vòng ngoài và vòng trong đã được tiến hành với các mồi đã được công bố và mô tả trong một nghiên cứutrước đây [24].

Nói ngắn gọn: đối với phân tích PCR vòng ngoài, đoạn DNA đã được khuếch đại trong một hỗn hợp phản ứng thể tích 20 µl có chứa 1x dung dịch đệm PCR (20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂), 200 µM dNTPs, 100 nM mỗi mồi và 1U Taq DNA polymerase (Qiagen, Hilden, Đức) trên mộtmáy luân nhiệt Eppendorf Nexus Gradient PCR Cycler (Eppendorf, Hamburg, Germany). Các thông số chu trình nhiệt cho lần khuếch đại PCR đầu là:biến tính ban đầu (denaturation) ở 94 °C trong 10 phút, tiếp theo là 35chu kỳ 30 giâybiến tính ở 94 °C, 30 giâyủ (annealing) ở 55 °C, 1 phútmở rộng (extension) ở 72 °C, theo sau đó là lần mở rộng cuối cùng 10 phútở 72 °C. Các phân tíchPCRvòng trong đối với các họ alen MAD20, K1 và RO33 (msp1) và 3D7 và FC27 (msp2) đã được tiến hành lần lượt với các DNA mẫu của msp1 và msp2 của phân tích PCR vòng ngoài. Tất cả năm phản ứng đã được tiến hành độc lập trong một hỗn hợp phản ứng 25 µl có chứa 3 µl từ DNA mẫu phân tích PCR vòng ngoài, 1x dung dịch đệm PCR, 1U Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Đức), 200 µM dNTPs, 100 nM mồi xuôi và ngược(Eurofins Genomic, Ebersberg, Đức). Các điều kiện phản ứng PCR này đều giống với các điều kiện củaphản ứng PCR vòng ngoài, ngoại trừ rằng nhiệt độ ủlà 61 °C đối với các họ alen msp1 và 56 °C đối với các họ alen msp2. Đối với các phép chứng dương msp1,DNA P.falciparum đã được phân lập từ các chủng Dd2, NF54 và 7G8 lần lượt đối với các alen MAD20, K1 và RO33. Đối với các phép chứng dương msp2, DNA đã được phân lập từ các chủng P.falciparum Dd2 và NF54 lần lượt đối với các alen 3D7 và FC27.

Hệ thống máy QIAxcel Advanced (Qiagen, Hilden, Đức) đã được sử dụng để tách rời các amplicon bằng điện di mao quản. Tất cả các sản phẩm PCR lồng đã được tiến hành theogiao thức AM420 sử dụng size marker QX-DNA 50–800 bp (Qiagen, Hilden, Đức) vàalignment marker QX 15 bp/1 kb (Qiagen, Hilden, Đức), ngoại trừ các sản phẩm PCR lồng của họ alen msp1 K1. Các sản phẩm PCR K1 lồng đã được tiến hành bằng giao thức AM420 cùng với size marker QX DNA 100 bp − 2.5 kb (Qiagen, Hilden, Đức) và alignment marker QX 15 bp/3 kb (Qiagen, Hilden, Đức).

Các kết quả đã được phân tích bằng phần mềm QIAxcel Screen Gel (Phiên bản 1.5.0.16, Qiagen, Hilden, Đức). Tất cả các chứng dương thu được một peak, ngoại trừ chứng dương FC27 cho thấyrõ hai peak trong mỗi lần chạy (MAD20: 201, K1: 242 bp, RO33: 154 bp, 3D7: 237 bp, FC27: 469/623 bp). Mỗi band đại diện cho một alen trong các họ alen tương ứng (Hình. 1).

Hình 1

Điện di mao quản độ phân giải cao trên một hệ thống QIAxcel Advanced, các Amplicons đã được phân tách dựa trên kích thước và sau đó được phân tích bằng phần mềm QIAxcel ScreenGel

Nhiễm đa alen (MOI)

Giá trị MOI đã được định nghĩa là số trung bình của các kểu gen P. falciparum trên mỗi đối tượng nhiễm bệnh. Giá trị MOI đã được tính là tỷ lệ tổng số các kểu genmsp1 và msp2 P. falciparum trên tổng số các bản phân lập dương tính PCR. Các bản phân lập chỉ với một alen tại mỗi locus được coi là nhiễm đơn dòng. Các ca nhiễm có nhiều hơn một alen tại một hoặc nhiều locus được coi là nhiễm từ nhiều dòng.

Định loại loài Plasmodium

Trên tổng cộng 222 mẫu được sàng lọc, 166 (75%) bản phân lập dương tính với P. falciparum, 32 (14%) bản phân lập dương tính với for P. vivax, một bản phân lập dương tính với P. malariae và 20 (9%) bản phân lập dương tính với cả P. falciparum và P. vivax, cho thấy nhiễm phối hợp. Ngoài ra, chúng tôi không phát hiện bản phân lập nào dương tính với P. ovale curtisi và P. ovale wallikeri. Tổng cộng 3 (2%) bản phân lập có kết quả âm tính PCR.

Tần số alen và sự đa dạng di truyền

Tất cả 166 bản phân lập dương tính với P. falciparum bằng real-time PCR lồng sau đó đã được xác định kiểu gen đối với hai locus msp1 và msp2. (Bảng 2). Tổng cộng 160 bản phân lập đã được khuếch đại thành công đối với locus genmsp1 và 153 bản phân lậpđối với locus gen msp2. Họ alen MAD20 chiếm ưu thế trong 159 bản phân lập (99%) và theo sau bởi họ alen K1 trong 74 bản phân lập (46%), và hoàn toàn không xuất hiện họ alen RO33. Trong locus msp1, 85 (53%) bản phân lập chỉ dương tính với MAD20 và 73 (46%) bản phân lập dương tính với cả MAD20 và K1, ngoại trừ 1 bản phân lập (0.6%) chỉ dương tính với K1. Trong locus msp2, họ alen 3D7 chiếm ưu thế trong 148 bản phân lập (97%) và họ alen FC27 xuất hiện trong 16 bản phân lập (10%). Tổng cộng of 137 bản phân lập (90%) dương tính với 3D7 và 11 bản phân lập (7%) dương tính với cả 3D7 và FC27. Đã có lên tới 7 alen khác nhau đối với msp1, với các kích thước alen khác nhau từ 141 đến 255 bpp (MAD20) và 161–1270 bp (K1). Đã có lên tới 4 alen khác nhau đối với msp2, với kích thước alen khác nhau từ 248 đến 650 bp (3D7) và 366–531 bp (FC27).

Bảng 2. Sự phân bổ các alen msp1 và msp2

Nhiễm đa alen (MOI)

Giá trị nhiễm đa alen đã được tính từ các kết quả xác định kiểu gen msp1 và msp2. Giá trị MOI trung bình 2.6 ± 1 đối với msp1 và MOI trung bình 1.1 ± 0.5 đối với msp2, và MOI chung củamsp1 và msp2 là 3.7 ± 1.2. Không có sự phân bổ đáng kể giá trị MOI giữa các nhóm tuổi.

Trong nghiên cứu này, 222 mẫu phân lập lâm sàng đã được xét nghiệm xác định loài Plasmodium bằng biện phápreal-time qPCR lồng độ nhạy cao và giải mã sự đa dạng di truyền củaP. falciparum, và giá trị MOI bằng các công dụ dịch tễ học phân tử.

Từ các kết quả phân tích real-time PCR lồng, đã phát hiện tỷ lệ75% P.falciparum, 15% P.vivax và 8% nhiễm phối hợp P.falciparum/P.vivax. Các kết quả này khác biệt không quá nhiều so với các kết quả của WHO là 64% được báo cáo nhiễm P. falciparum và 35% đối với P. vivax tại Việt Nam [25]. Sự khác biệt này có thể là do nghiên cứu này sử dụng phân tích real-time PCR độ nhạy caovà đủ nhạy để phát hiện các ca nhiễm dưới ngưỡng phát hiện của kính hiển vi. Một nghiên cứu khác đã cho thấy rằng qua theo dõi trong giai đoạn từ tháng 12/2013 đến tháng 1/2016 cho thấy tỷ lệ 36% P.falciparum, 27% P.vivax, 25% nhiễm phối hợp P.falciparum và P.vivax và 12% loài chưa xác định cũng tại Việt Nam [26]. Bên cạnh đó, số liệu báo cáo từ năm 2006 đến 2010 cho thấy 70% ca nhiễm tại Việt Nam là do P.falciparum. Tuy nhiên, do thực hiện các biện pháp phòng chống, từ năm 2014 đã có sự tác động lớn đến loài P. falciparum hơn là đối với P. vivax, và dẫn đến tỷ số gần như tương đồng nhaugiữa hai loài này.[27]. Ngoài ra, nhiễm phối hợp P. knowlesi và P. vivax đã được ghi nhận trên những con muỗi và cả con người ở Miền Nam Việt Nam. [28].

Việc sử dụng ACT có thể có ích lợi cho toàn bộ cộng đồng trong phòng chống sốt rét do tác động của loại thuốc này trong việc giảm thiểu sự lan truyềngiao bào, giai đoạn hữu tính của ký sinh trùng, lan truyền từ người sang muỗiAnopheles khi muỗi đốt người [29, 30]. Khả năng tiêu diệt nhanh chóng các giai đoạn vô tính ký sinh trùng bằng artemisinin (tỷ lệ tiêu diệt hàng ngày 99%) [29, 30] và, khi kết hợp với một thuốc phối hợp, sẽ giúp giảm nồng độ ký sinh trùng trong máu tới mức dưới ngưỡng phát hiện của kính hiển vi sau 3 ngày điều trị [31]. Dù sốt rét P.falciparum đã giảm trong 10 năm qua, và ACT vẫn được coi là một thành phần trong các nỗ lực phòng chống sốt rét toàn diện,việc giảm thiểu số ca sốt rét P.falciparum tại các tỉnh trọng điểm này vẫn còn là một thách thức. Dù rằng cũng phải kể đến các biện pháp như phun tồn lưu trong nhà, màn ngủ tẩm hóa chất diệt côn trùng (ITN) cũng góp phần vào những thay đổi dịch tễ học sốt rét tích cực này. Các nghiên cứu hiệu lực điều trị của loại thuốc điều trị tuyến đầu DHA-PPQ tại các điểm theo dõi trọng điểm quốc gia đã cho thấy sự chậm làm sạch ký sinh trùng tại tỉnh Gia Lai(2010), tỉnh Đăk Nông (2011), tỉnh Quảng Nam (2012), tỉnh Khánh Hòa (2014) và tỉnh Ninh Thuận (2015), với hơn 10% bệnh nhân dương tính kính hiển vi vào ngày D3 sau khi điều trị [32, 33].

Trong tình hình hiện nay khicác loại thuốc sốt rét trong khu vực này ngày càng trở nênquan trọng, sự đa dạng di truyền của msp1 và msp2 P.falciparum nên được theo dõi thường xuyên vì có tác động đến kết quả điều trị và/hoặc các nghiên cứu hiệu lực điều trị trong khu vực này, nơi tình hình dịch tễ học sốt rét vẫn đang thay đổi không ngừng, như đã nêu ở trên[8, 9]. Khi đi sâu vào tìm hiểu phạm vi đa dạng di truyền của ký sinh trùngtại các tỉnh này, họ alen MAD20msp1 (99%) và họ alen3D7 msp2 cho thấy sự chiếm ưu thế vượt trội (97%). Các kết quả này cũng tương đồng với một nghiên cứu trước đó tại Việt Nam [17]. Một nghiên cứu theo thời gian (longitudinal study) khác tại khu vực này, tại Myanmar trong giai đoạn 2004-2006 và 2013-2015 đã cho thấy sự thay đổi trong sự phân bố các alen msp1 và msp2 theo thời gian [19]. Ví dụ, tỷ lệ RO33 thay đổi từ 0% (2004–2006) lên 21% (2013–2015). Alen RO33 cho thấy mới chỉxuất hiện ở tần số thấp tại khu vực địa lý này, cũng như tại Myanmar nơi mà sự xuất hiện của alen này trong ký sinh trùng cũng còn hiếm[34, 35]. Dù vậy, MAD20 và 3D7 vẫn chiếm ưu thế vượt trội trong gần hai thập kỷ [19].

Các nghiên cứu với giá trị nhiễm đa alen (MOI) còn hiếm tại Việt Nam. Giá trị MOI chung của gen msp1 và msp2 trong nghiên cứu này lần lượt là 2,6 và 1,1,và các con số này khác biệt so với các giá trị ở Thái Lan và Lào dù có khoảng cách địa lý gần Việt Nam. Đối với gen msp1, the giá trị MOI tại Thái Lan và Lào lần lượt là 1,7 và 1,6, và đối với gen msp2, giá trị MOI tại Thái Lan là 2,5 [36, 37]. Sự khác biệt này có thể là do những khác biệt trong cường độ lan truyền, quần thể và khu vực địa lý. Và trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hệ thống QIAxcel Advanced, so với các nghiên cứu trước đó được tiến hành bằng điện di phiến gel (slab gel electrophoresis). Biện pháp điện di mao quản trong nghiên cứu này hoạt động tự động,độ phân giải cao, nhạy đã tiến hành phân tích đoạn DNA bằng phần mềm QIAxcel ScreenGel có khả năng phân biệt các alen có độ phân giải 3-5 bp.

Mặc dù tình trạng kháng thuốc sốt rét ngày càng gia tăng được báo cáo tại khu vực này,kết quả của chúng tôi lại cho thấy sự đa dạng di truyền ký sinh trùngở mức độ thấp tới trung bình tại các tỉnh bệnh lưu hành trọng điểm tại Việt Nam dựa trên sự đa dạng di truyền của các genmsp1 và msp2 P. falciparum. Việc theo dõi thường quy sự đa dạng di truyền của ký sinh trùng có tác dụngto lớnđến các kết quả điều trị và/hoặc các nghiên cứu hiệu lực điều trị trong tình hình dịch tễ học sốt rét không ngừng thay đổi từng ngày.

1.WHO. World malaria report 2019. Geneva: World Health Organization; 2019. Google Scholar 

2.Goldlust SM, Thuan PD, Giang DDH, Thang ND, Thwaites GE, Farrar J, et al. The decline of malaria in Vietnam, 1991–2014. Malar J. 2018;17:226. ArticleGoogle Scholar 

3.Phuong NL. Viet Nam ready to eliminate malaria. Geneva: World Health Organization; 2018. Google Scholar 

4.Velavan TP, Nderu D, Agbenyega T, Ntoumi F, Kremsner PG. An alternative dogma o­n reduced artemisinin susceptibility: a new shadow from east to west. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116:12611–2. CASArticleGoogle Scholar 

5.Kremsner PG, Adegnika AA, Hounkpatin AB, Zinsou JF, Taylor TE, Chimalizeni Y, et al. Intramuscular artesunate for severe malaria in African children: a multicenter randomized controlled trial. PLoS Med. 2016;13:e1001938. ArticleGoogle Scholar 

6.Krishna S, Staines HM, Kremsner PG. Artemisinin resistance and the blame game. Clin Infect Dis. 2016;63:1144–5. ArticleGoogle Scholar 

7.Nguetse CN, Adegnika AA, Agbenyega T, Ogutu BR, Krishna S, Kremsner PG, et al. Molecular markers of anti-malarial drug resistance in Central, West and East African children with severe malaria. Malar J. 2017;16:217. ArticleGoogle Scholar 

8.Zhong D, Lo E, Wang X, Yewhalaw D, Zhou G, Atieli HE, et al. Multiplicity and molecular epidemiology of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum infections in East Africa. Malar J. 2018;17:185. ArticleGoogle Scholar 

9.Some AF, Bazie T, Zongo I, Yerbanga RS, Nikiema F, Neya C, et al. Plasmodium falciparum msp1 and msp2 genetic diversity and allele frequencies in parasites isolated from symptomatic malaria patients in Bobo-Dioulasso, Burkina Faso. Parasit Vectors. 2018;11:323. ArticleGoogle Scholar 

10.Mahdi Abdel Hamid M, Elamin AF, Albsheer MM, Abdalla AA, Mahgoub NS, Mustafa SO, et al. Multiplicity of infection and genetic diversity of Plasmodium falciparum isolates from patients with uncomplicated and severe malaria in Gezira State, Sudan. Parasit Vectors. 2016;9:362. ArticleGoogle Scholar 

11.Nguetse CN, Ojo JA, Nchotebah C, Ikegbunam MN, Meyer CG, Thomas BN, et al. Genetic diversity of the Plasmodium falciparum glutamate-rich protein r2 region before and twelve years after introduction of artemisinin combination therapies among febrile children in Nigeria. Am J Trop Med Hyg. 2018;98:667–76. CASArticleGoogle Scholar 

12.Takala SL, Escalante AA, Branch OH, Kariuki S, Biswas S, Chaiyaroj SC, et al. Genetic diversity in the Block 2 region of the merozoite surface protein 1 (MSP-1) of Plasmodium falciparum: additional complexity and selection and convergence in fragment size polymorphism. Infect Genet Evol. 2006;6:417–24. CASArticleGoogle Scholar 

13.Apinjoh TO, Tata RB, Anchang-Kimbi JK, Chi HF, Fon EM, Mugri RN, et al. Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 block 2 gene polymorphism in field isolates along the slope of mount Cameroon: a cross - sectional study. BMC Infect Dis. 2015;15:309. ArticleGoogle Scholar 

14.Genton B, Betuela I, Felger I, Al-Yaman F, Anders RF, Saul A, Rare L, et al. A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure o­n parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea. J Infect Dis. 2002;185:820–7. ArticleGoogle Scholar 

15.McCarthy JS, Marjason J, Elliott S, Fahey P, Bang G, Malkin E, et al. A phase 1 trial of MSP2-C1, a blood-stage malaria vaccine containing 2 isoforms of MSP2 formulated with Montanide(R) ISA 720. PLoS o­ne. 2011;6:e24413. CASArticleGoogle Scholar 

16.Mombo-Ngoma G, Remppis J, Sievers M, Zoleko Manego R, Endamne L, et al. Efficacy and safety of fosmidomycin-piperaquine as nonartemisinin-based combination therapy for uncomplicated falciparum malaria: a single-arm, age de-escalation proof-of-concept study in Gabon. Clin Infect Dis. 2018;66:1823–30. CASArticleGoogle Scholar 

17.Aspeling-Jones H, Conway DJ. An expanded global inventory of allelic variation in the most extremely polymorphic region of Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 provided by short read sequence data. Malar J. 2018;17:345. CASArticleGoogle Scholar 

18.Ferreira MU, Liu Q, Zhou M, Kimura M, Kaneko O, Van Thien H, et al. Stable patterns of allelic diversity at themerozoite surface protein-1 locus of Plasmodium falciparum in clinical isolates from southern Vietnam. J Eukaryot Microbiol. 1998;45:131–6. CASArticleGoogle Scholar 

19.Le HG, Kang JM, Jun H, Lee J, Thai TL, Myint MK, et al. Changing pattern of the genetic diversities of Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 and merozoite surface protein-2 in Myanmar isolates. Malar J. 2019;8:241. ArticleGoogle Scholar 

20.Groger M, Veletzky L, Lalremruata A, Cattaneo C, Mischlinger J, Zoleko-Manego R, et al. Prospective clinical trial assessing species-specific efficacy of artemether-lumefantrine for the treatment of Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, and mixed Plasmodium malaria in Gabon. Antimicrob Agents Chemother. 2018;62:e01758-17. ArticleGoogle Scholar 

21.Snounou G, Viriyakosol S, Zhu XP, Jarra W, Pinheiro L, do Rosario VE, et al. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Mol Biochem Parasitol. 1993;61:315–20. CASArticleGoogle Scholar 

22.Veron V, Legrand E, Yrinesi J, Volney B, Simon S, Carme B. Genetic diversity of msp3alpha and msp1_b5 markers of Plasmodium vivax in French Guiana. Malar J. 2009;8:40. ArticleGoogle Scholar 

23.Kamau E, Alemayehu S, Feghali KC, Saunders D, Ockenhouse CF. Multiplex qPCR for detection and absolute quantification of malaria. PLoS o­nE. 2013;8:e71539. CASArticleGoogle Scholar 

24.Atroosh WM, Al-Mekhlafi HM, Mahdy MA, Saif-Ali R, Al-Mekhlafi AM, Surin J. Genetic diversity of Plasmodium falciparum isolates from Pahang, Malaysia based o­n MSP-1 and MSP-2 genes. Parasit Vectors. 2011;4:233. CASArticleGoogle Scholar 

25.WHO. Malaria Country Profiles Viet Nam. Geneva: World Health Organization; 2018.Google Scholar 

26.Nguyen TN, von Seidlein L, Nguyen TV, Truong PN, Hung SD, Pham HT, et al. The persistence and oscillations of submicroscopic Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax infections over time in Vietnam: an open cohort study. Lancet Infect Dis. 2018;18:565–72. ArticleGoogle Scholar 

27.Kattenberg JH, Erhart A, Truong MH, Rovira-Vallbona E, Vu KAD, Nguyen THN, et al. Characterization of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax recent exposure in an area of significantly decreased transmission intensity in Central Vietnam. Malar J. 2018;17:180. ArticleGoogle Scholar 

28.Marchand RP, Culleton R, Maeno Y, Quang NT, Nakazawa S. Co-infections of Plasmodium knowlesi, P. falciparum, and P. vivax among humans and Anopheles dirus mosquitoes, Southern Vietnam. Emerg Infect Dis. 2011;17:1232–9. ArticleGoogle Scholar 

29.Targett G, Drakeley C, Jawara M, von Seidlein L, Coleman R, Deen J, et al. Artesunate reduces but does not prevent posttreatment transmission of Plasmodium falciparum to Anopheles gambiae. J Infect Dis. 2001;183:1254–9.CASArticleGoogle Scholar 

30.Bousema JT, Schneider P, Gouagna LC, Drakeley CJ, Tostmann A, Houben R, et al. Moderate effect of artemisinin-based combination therapy o­n transmission of Plasmodium falciparum. J Infect Dis. 2006;193:1151–9.CASArticleGoogle Scholar 

31.White NJ. Qinghaosu (artemisinin): the price of success. Science. 2008;320:330–4. CASArticleGoogle Scholar