Hình 1: Sơ đồ tổng quát thu nhận vùng gen dài 4,2 kb của các chủng OvQN, OvBD1, OvPY3 của Việt Nam và OvKK của Thái Lan. Trên cùng là sơ đồ hệ gen ty thể các loài sán lá, với các khung gen mã hoá protein và vị trí gen RNA vận chuyển.

Kết quả phân tích trật tự sắp xếp gen trong vùng gen ty thể dài 4,2 kb của các chủng sán lá gan nhỏ O. viverrini

Sử dụng chương trình MacVector8.2 (Accelrys Inc.) để phân tích trật tự các gen, kết quả cho thấy, vùng gen ty thể này chứa 5 gen mã hóa protein là nad4, atp6, nad2, nad1, nad3 và 11 gen mã hóa cho RNA vận chuyển amino acid là trnQ (Glutamine), trnF (Phenylalanine), trnM (Methionine), trnV (Valine), trnA (Alanine), trnD (Aspartate), trnN (Asparagine), trnP (Proline), trnI (Isoleucine), trnK (Lysine) và trnS1 (Serine) (Hình 1). Cụm gen nad4, atp6, nad2, nad1, nad3, là các gen mã hoá và chịu trách nhiệm tổng hợp các enzym có vai trò quan trọng trong hoạt động dẫn truyền điện tử và tạo năng lượng của ty thể. Những gen này thông thường được bảo tồn cao giữa các chủng trong loài, và giữa các loài trong một giống và lớp phân loại.

Bảng 1: Vị trí các gen mã hoá protein và các trình tự nối các gen (vùng giao gen) trong vùng gen ty thể dài 4,2 kb của các chủng O. viverrini

Phân tích trật tự sắp xếp các gen trong vùng DNA ty thể dài 4,2 kb

Trong vùng 4,2 kb này, trật tự các gen được sắp xếp như trình bày ở Bảng 1. Bắt đầu là một phần gen nad4 với độ dài là 807 nucleotide, tiếp đến là vùng giao gen (intergenic region) có độ dài 7 nucleotide, rồi đến RNA vận chuyển, trnQ (Glutamine) dài 63 nucleotide, đến 1 vùng giao gen ngắn (12 nucleotide), tiếp đến là 2 gen RNA vận chuyển trnF (Phenylalanine) có độ dài là 66 và trnM (Methionine) dài 67 nucleotide, đây là 2 gen nằm kế tiếp nhau, không có sự ngắt quãng của vùng giao gen. Tiếp theo là gen mã hóa cho atp6, dài 516 nucleotide; vùng giao gen dài 18 nucleotide; gen mã hóa nad2, dài 870 nucleotide; tiếp đến là vùng giao gen dài 14 nucleotide, tiếp theo là 3 gen RNA vận chuyển, trnV (Valine) dài 66 nucleotide, trnA (Alanine) dài 62 nucleotide và trnD (Aspartate) dài 68 nucleotide. Giữa các gen RNA vận chuyển trnV và trnA có vùng giao gen kích thước là 30 nucleotide; giữa trnA và trnD có 5 nucleotide. Sau gen RNA vận chuyển trnD là vùng giao gen dài 4 nucleotide; nối tiếp theo đó là gen nad1 dài 903 nucleotide, vùng giao gen dài 5 nucleotide, tiếp theo là 4 gen ARN vận chuyển trnN (Asparagine), trnP (Proline), trnI (Isoleucine) và trnK (Lysine), trong đó trnN dài 69 nucleotide, cách trnP (64 nucleotide) bởi một vùng giao gendài 4 nucleotide; trnP cách trnI bằng một trình tự dài 16 nucleotide, trnI và trnK là 2 gen nằm sát nhau có kích thước là 65 và 66 nucleotide; tiếp theo là gen nad3, được bắt đầu cách trnK có 1 nucleotide, gen này dài 357 nucleotide và cuối cùng trình tự dài 27 nucleotide của một phần của gen RNA vận chuyển Serine (trnS1).

Kết quả phân tích trật tự các gen nằm trong vùng gen dài 4.252 nucleotide, cho thấy trật tự các gen mã hóa protein và các RNA vận chuyển cũng giống với các loài sán dẹt đã được nghiên cứu trước đây, ngoại trừ sán máng châu Phi và Ấn Độ. Đây là công bố đầu tiên về trật tự và thành phần gen của loài sán lágan nhỏ O. viverrini của vùng gen ty thể dài 4,2 kb.

Phân tích sự biến đổi về thành phần nucleotide giữa các chủng O. viverrini của Việt Nam và Thái Lan trong vùng gen ty thể dài 4,2 kb

Kết quả giải trình trình tự cho thấy, vùng DNA giới hạn giữa cặp mồi Ov8F-OvR (Hình 1) có độ dài 4.252 bp ở các chủng O. viverrini là OvQN, OvPY3 của Việt Nam và OvKK của Thái Lan. Riêng đối với chủng OvBD1 (Việt Nam), vùng này có độ dài là 4.253 nucleotide, do chủng OvBD1 có đột biến thêm vào một nucleotde (T) tại vị trí 816 so với 3 chủng còn lại, tuy nhiên sự đột biến này xảy ra ở vùng giao gen nên cũng không gây nên sự thay đổi nào về amino acid. Các chuỗi này đã được đăng ký Ngân hàng gen: OvBD1 (số: EU443831), OvQN (số: EU443832), OvPY3 (số: EU443833).

Có tất cả 58 vị trí sai khác giữa các chủng O. viverrini với nhau, chiếm tỷ lệ 1,36% (Bảng 2, A-B-C-D). Đây là tỷ lệ sai khác cho phép giữa các chủng trong cùng một loài. Trong số 58 đột biến, có 9/58 là đột biến dị hoán(tranversion), chiếm tỷ lệ 15,5%; và 48/58 nucleotide là đột biến đồng hoán (transition), chiếm tỷ lệ 84,5%.

Phân tích thành phần các nucleotide kiến tạo vùng gen ty thể 4,2 kb của các chủng O viverrini của Việt Nam và Thái Lan

Một trong những đặc tính sinh học cần phân tích là tìm hiểu thành phần nucleotide được sử dụng để kiến tạo nên gen hoặc hệ gen, cũng như tỷ lệ cácnucleotide riêng biệt và tỷ lệ A+T và G+C trong thành phần chuỗi gen. Kết quả phân tích thành phần các nucleotide sử dụng kiến tạo vùng gen ty thể 4,2 kb (chính xác là 4.253 bp của OvBD1 và 4.252 bp của OvQN, OvPY3 và OvKK) (Bảng 3) cho thấy, tất cả các chủng sử dụng 44,1-44,3% Thymine (T); 12,2-12,3% Cytosine (C); 15,9% Adenine (A); và 27,6% Guanine (G) để kiến tạo vùng gen ty thể dài 4.252-4.253 bp, hoàn toàn đồng nhất với kết quả nghiên cứu trước đây của chúng tôi về loài này (Ngô Thị Hương và cs, 2006). Tỷ lệ A+T là 60% và G+C là 40%. Đây là một tỷ lệ sử dụng A+T và G+C thông dụng ở các loài sán lá gan lớn (Fasciola spp) và sán lá phổi (Paragonimus spp). Như vậy, ở sán lá gan nhỏ O. viverrini, tỷ lệ này cũng tương đồng với các loài sán lá nói chung được khảo sát cho đến nay, trừ các loài sán máng Schistosoma spp. Sán máng Schistosoma spp có tỷ lệ sử dụng A+T vượt trội (đến 70%) và sử dụng các nucleotide G+C ít hơn (khoảng 30%) (Le et al, 2002; Le et al, 2004; Le et al, 2001).

Bảng 3: Thành phần nucleotide sử dụng trong vùng gen ty thể 4,2 kb (4.252 nucleotide) của các chủng Việt Nam và Thái Lan (No: số nucleotide; %: tỷ lệ so với toàn bộ số nucleotide của chuỗi gen 4,2 kb)

1877

15,9

Kết luận

- Vùng gen được giải mã có độ dài 4.252 nucleotide đối với 3 chủng O. viverrini là OvQN, OvPY3 và OvKK, và 4253 nucleotide đối với chủng OvBD1 do có đột biến thêm vào 1 nucleotide Thymine (T).

- Có tất cả 58 vị trí sai khác giữa các chủng O. viverrini với nhau, chiếm tỷ lệ 1,36%, trong đó có 9/58 là đột biến dị hoán(tranversion), chiếm tỷ lệ 15,5%; và 48/58 nucleotide là đột biến đồng hoán (transition), chiếm tỷ lệ 84,5%.

- Vùng gen này bao gồm 16 gen, trong đó có 5 gen mã hóa protein và 11 gen mã hóa cho các RNA vận chuyển amino acid, với trật tự sắp xếp các gen giống như ở các loài sán dẹt đã được nghiên cứu trước đây.

- Tỷ lệ sử dụng A+T là 60% và G+C là 40%, tương tự với các loài sán lá nói chung đã được khảo sát cho đến nay.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jongsuksuntigul P, Imsomboon T (2003) Opisthorchiasis control in Thailand. Acta Trop. 88(3): 229-232. Review.

2. Le TH, Blair D, McManus DP (2002) Mitochondrial genomes of parasitic flatworms. Trends Parasitol. 18: 206-213.

3. Le TH, Blair D, McManus DP (2004) Codon usage and bias in mitochondrial genome of platyhelminths. Korean J Parasitol. 42(4): 159-167.

4. Le TH, De NV, Blair D, Sithithaworn P, McManus DP (2006) Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini: development of a mitochondrial-based multiplex PCR for their identification and discrimination. Experimental Parasitology, 112(2): 109-114.

5. Le TH., Humair PF, Blair D, Agatsuma T, Littlewood DT, McManus DP (2001) Mitochondrial gene content, arrangement and composition compared in African and Asian schistosomes. Mol. Biochem.Parasitol. 117: 61-71.

6. Ngô Thị Hương, Lê Thanh Hòa, Triệu Nguyên Trung, Nguyễn Văn Chương, Bùi Văn Tuấn (2006) Giám định loài sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini ở Bình Định và Phú Yên bằng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể. Tạp chí Y học Việt Nam, 326(9): 47-53.

7. Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà (2006) Xác định thành phần loài sán lá gan nhỏ ký sinh trên người tại 10 tỉnh ở Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử hệ gen ty thể, Tạp chí Nghiên cứu Y học 5: 14-18.

8. Nicholas KB, Nicholas HB (1999) GeneDoc: a tool for editting and annotating multiple sequence alignments. Distributed by author.

9. Sripa B (2003) Pathobiology of opisthorchiasis: an update. Acta Trop. 88(3): 209-220. Review.

10. Sripa B, Kaewkes S, Sithithaworn P, Mairiang E, Laha T, Smout M, Pairojkul C, Bhudhisawasdi V, Tesana S, Thinkamrop B, Bethony JM, Loukas A, Brindley PJ (2007) Liver fluke induces cholangiocarcinoma. PLoS Med. 4(7): 1148-1155. Review.