Sán lá gan lớn là căn bệnh của quá khứ song rất thời sự. Triclabendazole (TCBZ) là thuốc lựa chọn điều trị bệnh sán lá gan lớn (SLGL) ở gia súc hơn 20 năm qua do thuốc có hoạt tính cao chống lại cả thể sán non và trưởng thành. Nhiều nghiên cứu gần đây cho biết thuốc đã được sử dụng điều trị thành công bệnh SLGL trên người. Kháng thuốc với TCBZ đã lan rộng và nghiêm trọng trong lĩnh vực thú y và dường như chưa có thuốc nào hiện nay thay thế cho điều trị và phòng bệnh sán lá gan như TCBZ, hiện tượng kháng thuốc TCBZ lần đầu tiên được ghi nhận tại các nông trang ở Úc vào giữa những năm 1990.

Kể từ đó, tình hình kháng thuốc đuợc báo cáo tại nhiều quốc gia châu Âu như Ireland, Scotland, xứ Wales, Tây Ban Nha, Hà Lan. Mặc dù đến nay chưa có ca sán lá gan nào ở người kháng thuốc TCBZ được xác định, song trong thực tiễn lâm sàng đã có khá nhiều ca tỏ ra giảm nhạy với thuốc nhiều năm qua. Từ đó, niềm tin vào chiến lược điều trị SLGL liều duy nhất bằng loại thuốc này là nguy cơ lớn và cần có sự cảnh báo sớm. Bài tổng hợp này sẽ trình bày tổng quan về diễn tiến sự hiểu biết về cơ chế kháng TCBZ, và có thể có sự thay đổi trong các phân tử đích cũng như trong những cơ chế vào/ra của thuốc (drug influx/efflux mechanisms) và sự chuyển hóa của thuốc TCBZ bởi sán. Ngoài ra, bài trình bày cũng sẽ đề cập đến một số hướng giải quyết khi đối mặt với kháng, bao gồm việc lựa chọn có định hướng các thuốc như những thuốc thay thế, phối hợp thuốc và quá trình nghiên cứu các hợp chất mới. Và cuối cùng, rõ ràng là sự hiểu biết của chúng ta về cơ chế kháng thuốc vẫn còn đợi nhiều nghiên cứu nhân rộng và sự ứng dụng nhiều kỹ thuật tiên tiến mới mong hiểu thấu đáo.

MỞ ĐẦU

Triclabendazole (TCBZ) là một thuốc lựa chọn trong điều trị bệnh sán lá gan lớn ở các vật nuôi hơn 20 năm qua. Gần đây, thuốc cũng đã được sử dụng điều trị thành công nhiều ca bệnh sán lá gan ở người. Hiện tượng kháng thuốc TCBZ dường như lần đầu tiên phát hiện ở trên các động vật chăn thả trên nông trang ở Úc vào giữa những năm 1990 (Overend và Bowen, 1995) và kể từ đó nhiều quốc gia ở châu Âu cũng đã báo cáo về tình trạng kháng này (Ireland, Anh, Hà Lan, Tây Ban Nha) (Fairweather và cs., 2005). Đến nay, dường như chưa có ca bệnh SLGL trên người nào được xác định có kháng với TCBZ mặc dù có sự xuất hiện tình hình kháng thuốc trên gia súc ở đó hoặc nhiều ca bệnh tỏ ra giảm nhạy với thuốc TCBZ (H.H.Quang và cs., 2006, 2007, 2008) mặc dù đã dùng tăng liều gấp đôi hoặc đã dùng đến liều thứ 3. Việc kháng thuốc TCBZ ở gia súc ngày càng lan rộng và nghiêm trọng như là nguy cơ trong tương lai đối với các chiến lược điều trị SLGL cho gia súc dễ thất bại và đặc biệt càng lo lắng hơn trong thời điểm này tình hình mắc và lan rộng bệnh rất lớn, nhất là khi có sự biến đổi khí hậu toàn cầu. Sự thay đổi khí hậu toàn cầu chịu trách nhiệm cho hiện tượng tăng này, điều kiện môi trường ấm và ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho sự sống sót của các vật chủ ốc (Mitchell và cs., 2002).

Mặc dù với hiện tượng kháng thuốc lan rộng và ngày càng nghiêm trọng như hiện nay trong khía cạnh thú y thì vấn đề kháng thuốc trên người dự kiến sẽ không còn xa nữa bởi nhiều lý do:

[1] bệnh ký sinh trùng nói chung và bệnh sán lá gan lớn ở người nói riêng hiện đang có xu hướng tăng tại một số quốc gia, trong đó có Việt Nam;

[2] các chuyên gia về ký sinh trùng trên thế giới đã nhận định và cảnh báo rằng hiện nay không còn xem bệnh sán lá gan lớn là một bệnh nhiễm tình cờ nữa mà nên xem đó là một bệnh ký sinh trùng quan trọng và

[3] phương cách sử dụng thuốc đặc hiệu triclabendazole chưa đúng, đôi khi còn bừa bãi, nhất là nay đang thời điểm thuốc TCBZ đang sẵn có bán trên thị trường. Do vậy, tình trạng này sẽ rất nguy hiểm khi chúng ta đối mặt với kháng thuốc, trong khi chưa có một ứng cử viên thuốc mới nào thay thế hoặc chỉ định chống kháng, nếu có quả chăng chỉ là đang trong giai đoạn nghiên cứu chứa chưa ra chính thức thị trường (Artemether, Artesunate, OZ78, Mirazid,...), hoặc phối hợp thuốc TCBZ với một loại thuốc khác OZ78, hoặc Artemether cũng cho nhiều kết quả ban đầu rất tốt (Keiser và cs.,2008)

Mục đích của bài tổng hợp này là tổng hợp các các công trình nghiên cứu đã được tiến hành chi tiết nhằm làm sáng tỏ cơ chế kháng. Khác nhưng tiến hành song song các tiếp cận về mặt phân tử, hình thái học, dược học và protein học đã và đang ứng dụng tại một số la bô tiên tiến để hoàn chỉnh hơn về bức tranh kháng thuốc. Vì bất kỳ một loại thuốc điều trị sán nào cũng phải tương tác với một số số hệ thống cơ quan bên trong cơ thể sán và đưa ra một loạt các hiệu ứng khác nhau. Một hiệu ứng (effect) trên một mô hoặc hệ thống sinh hóa có thể có một hiệu ứng lên trên các hệ thống cơ quan khác và vì thế thật khó để xác định có hay không hoạt động diệt sán là do một hiệu ứng riêng lẻ hay phối hợp của nhiều hiệu ứng. Hy vọng rằng với bài tổng hợp này sẽ minh họa các giá trị ghi nhận được về cơ chế tác dụng cũng như cơ chế kháng thuốc để chúng ta có hướng như thế nào làm chậm quá trình kháng chăng?

CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA THUỐC TRICLABENDAZOLE (TCBZ)

Để hiểu biết về cơ chế kháng thuốc TCBZ diễn ra như thế nào thì điều trước tiên cần thiết là phải biết được cơ chế tác dụng của thuốc.TCBZ là một dẫn chất thuộc nhóm benzimidazole và là analogy các chất thuộc nhóm thuốc benzimidazole, người ta cũng đã đoán trước liệu rằng TCBZ có thể gắn với phân tử β-tubulin và làm dừng quá trình tác động trên trên vi quản (microtubule). Các bằng chứng làm rõ và hỗ trợ cho quan điểm này dựa trên các bằng chứng nghiên cứu về mặt hình thái học (morphology) trên vỏ vi quản (tegument), tuyến noãn hoàn (vitellaria) và tinh hoàn (testis) khi điều trị bằng chất chuyển hóa sulphoxide của triclabendazole (TCBZ.SO). Chẳng hạn, có sự ức chế quá trình phân bào bên trong tuyến noãn hoàng và các tế bào sinh tinh (Stitt và Fairweather và cs., 1996); làm gián đoạn quá trình vận chuyển bên trong vi vỏ (lớp ngoài cùng của sán), dẫn đến tổn thương tiến triển nghiêm trọng bề mặt của vỏ sán và hậu quả cuối cùng là hủy mất toàn bộ cấu trúc vi vỏ (Stitt và Fairweather., 1994). Mất hình ảnh của vỏ ống qua hình ảnh nhuộm miễn dịch trong hợp bào ống cũng được quan sát (Robinson và cs., 2002; McConville và cs., 2006) (hình 1 và 2). Các kết quả trên cho thấy rằng các vi quản biến mất, ngăn cản sự chuyển động của các vật thể tiết từ các tế bào trên bề mặt của vi vỏ. Tiến trình này là duy trì sự sống còn và toàn vẹn của màng bề mặt cũng như sự gián đoạn như thế sẽ giải thích cho những thay đổi về hình thái học rất nghiêm trọng.

Biểu hiện kháng thuốc do sán lá gan lớn trên gia súc (trâu, bò, cừu) là ghi nhận sự sạch trứng theo thời gian uống thuốc và một số biểu hiện lâm sàng, trên người cũng vậy, song vì người từ lâu được coi là vật chủ tình cờ chứ không xem đó là vật chủ chính, nên việc sán xâm nhập và tồn tại đủ thời gian đến khi gây bệnh đã là khó, thì sán phát triển đến trưởng thành trong cơ thể người, rồi đến thời điểm đẻ trứng lại càng khó hơn; do đó, theo dõi đáp ứng điều trị trên người không chỉ dựa vào sự sạch trứng sán mà còn dựa trên nhiều yếu tố lâm sàng lẫn cận lâm sàng (hết đau, tổn thương trên siêu âm hồi phục, chỉ số bạch cầu ái toan và hiệu giá kháng thể trở về bình thường). Về mặt điều trị, qua gần 5 năm (2004-2009) theo dõi và điều trị với hơn 10.000 ca bệnh sán lá gan lớn ở người đến từ nhiều tỉnh thành khác nhau tại Việt Nam, con số ca bệnh không đáp ứng (nghi kháng?) với thuốc điều trị đặc hiệu TCBZ dù không nhiều (1.75%) nhưng cũng cảnh báo đã có sự giảm nhạy với thuốc TCBZ rồi.

CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC TRICLABENDAZOLE (TCBZ)

Nghiên cứu đi vào cơ chế kháng với TCBZ đã sử dụng phân lập Sligo của sán Fasciola hepatica. Phân lập này cho thấy kháng lại với cơ chế tác dụng trên in vivo của TCBZ ở cả giai đoạn sán non và sán trưởng thành (Coles và Stafford., 2001; McCoy và cs., 2005). Các con sán từ phân lập này cũng kháng với tác dụng của chất chuyển hóa TCBZ.SO trên in vitro, ngay cả ở những nồng độ thuốc cao hơn bình thường (Robinson và cs., 2002). Những cơ chế liên quan đến quá trình hình thành và phát triển kháng với các thuốc khác có thể dẫn đến từ sự thay đổi các phântử đích, trong cơ chế hấp thu và đào thải của thuốc (drug uptake / efflux) và trong quá trình chuyển hóa thuốc (Ouellette và cs., 2001). Liên đới đến các phân tử đích, đích chính là phân tử β-tubulin, nhưng khi nhuộm màu các tubulin thì không phát hiện thấy sự hủy hoại do chất chuyển hóa TCBZ.SO trong các phân lập sán kháng thuốc (Robinson và cs., 2002; McConville và cs., 2006) (hình 3). Tuy nhiên, sự đề kháng các thuốc nhóm benzimidazole do các loài giun tròn có liên quan một cách có chọn lọc của một β-tubulin isotype với kiểu thay đổi acid amine phenylalanine bằng tyrosine tại vị trí 167 hoặc vị trí 200 (Kwa và cs., 1994; Prichard và cs., 2001; Wolstenholme và cs., 2004), và có thể tình trạng kháng TCBZ ở các con sán sẽ tăng lên từ các cơ chế chọn lọc các biến thể isotype β-tubulin tương tự như thế này. Nhiều loài sinh vật có nhân điển hình (eukaryotic species) mã hóa cho hơn 1 β-tubulin isotype. So sánh trình tự các polypeptide dự kiến trước cho thấy có những vùng có thể thay đổi nhỏ giữa chúng với nhau, đáng chú ý nhất là tại vị trí C-terminus. Đến nay, một vài α- tubulin và β-tubulin isotype trình diện trên sán trưởng thành đã được xác định và những vùng mã hóa của chúng cũng đã được giải mã đầy đủ (Ryan và cs., 2008). So sánh trình tự của các β-tubulin từ các phân lập nhạy và kháng của sán (susceptible-resistant fluke isolates) cho thấy chúng chứa các acid amin giống nhau tại những vị trí liên quan đến kháng thuốc nhóm benzimidazole trên các giun tròn. Tuy nhiên, một số khác biệt về acid amin đã được lưu ý tại các vị trí khác nhưng liệu có hay chăng việc thay đổi các a.a này có liên quan đến kiểu hình kháng hay không hoặc do sự biến đổi các bình thường trong các gen mã hóa cho các isotype này vẫn được xác định và nhiều nghiên cứu giải trình tự các sán nhạy (TCBZ-susceptible_TCBZ-S) và kháng (TCBZ-resistant_TCBZ-R) riêng lẻ cần phải làm rõ. Các nghiên cứu được tiến hành trên cả sán non và sán trưởng thành để xác định các isotype nhạy với thuốc bằng cách định vị trí trình diễn của các α- và β-tubulin isotype khác nhau và nhờ đó cũng xác định isotype nào trình diện trên những vùng mà cấu trúc vi vỏ bị phá hủy nghiêm trọng sau khi điều trị bằng TCBZ.

Dưới góc độ phân tử, các nghiên cứu về cấu trúc đã cho biết rằng phần còn lại là có thể biến đổi trong các vi sinh vật kháng với nhóm benzimidazole (6, 50, 134, 165, 167, 198, 200 và 257) diễn ra đồng thời để hình thành nên một chùm protein β-tubulin (Downing và cs., 2000).

Các nghiên cứu này cũng đã chỉ ra các phần chùm nhạy còn lại không hiện diện trên bề mặt của các phân tử (hình 4), thêm một câu hỏi đặt ra là làm thế nào để thuốc tiếp cận đến các vùng này? Các nghiên cứu mô hình phân tử sử dụng giải trình tự β-tubulin từ các con sán lá gan lớn và giun tròn Haemonchus contortus đã đề xuất ra một giải pháp nhằm giải quyết vấn đề này (Robinson và cs., 2004). Nhờ quá trình suy luận liên quan đến các tubulin vi khuẩn FtsZ (Nogales và cs., 1998) góc giữa N-terminal, intermediate và C-terminal domains của phân tử β-tubulin dãn ra 11°. Điều này làm tăng diện tích bề mặt để việc gắn thuốc với benzimidazole tương đối, như albendazole khi tác động vào vùng này chẳng hạn. Các tubulin trên động vật có vú và sán lá gan hiện diện một vùng nhỏ hơn để gắn thuốc, cùng diện tích với các hiệu ứng giới hạn của benzimidazole trên các sinh vật này. Người ta cũng cho biết các đột biến dẫn đến kháng tại vị trí còn lại 200 và 167 là có hiệu quả vì chúng cho phép hình thành nên các cầu nối H₂ tạo ra hiệu ứng “closing off” gắn kết với thuốc. Mô hình này cũng chỉ ra rằng nhóm thuốc benzimidazole tác động không chỉ gây ra quá trình khử trùng hợp (de-polymerization) của các vi quản microtubule mà còn bằng cách khóa một nửa β- tubulin khi mở ra và vì thế nó can thiệp vào quá trình hình thành các chất nhị trùng hợp khác nhau với α-tubulins trước khi hình thành microtubule.

Đường vào cơ thể sán của thuốc TCBZ xảy ra chủ yếu nhờ vào sự khuyếch tán xuyên qua cấu trúc hợp bào vỏ hơn là qua con đường thực bào miệng (Mottier và cs., 2006). Sự khuyếch tán cả thuốc TCBZ và chất chuyển hóa TCBZ.SO vào trong các con sán kháng (hay TCBZ-R), còn gọi là phân lập Sligo thấp hơn đáng kể so với các con sán nhạy (hay TCBZ-S), còn gọi là phân lập Cullompton (Alvarez và cs., 2005; Mottier và cs., 2008). Một điều thú vị, điều này lại không liên quan đến benzimidazole, ví dụ hấp thu albendazole tương tự như giữa sán nhạyTCBZ-S và sán kháng TCBZ-R (Mottier và cs., 2008). Những kết quả cho thấy cơ chế đặc hiệu với TCBZ và bơm đẩy thuốc ra liên kết với phân tử P-glycoprotein, có thể điểm này liên quan đến cơ chế kháng (?). Sự trình diện quá mức của phân tử Pgp liên quan đến kháng thuốc ở các loài giun tròn khác nhau khi bị tác động bởi các thuốc điều trị (Kerboeuf và cs., 2003; Wolstenholme và cs., 2004). Thử nghiệm với chất ức chế Pgp cho thấy có thể có tình trạng đảo ngược do sán, khác nhau giữa các chủng kháng và nhạy. Chẳng hạn, khi cùng ủ với thuốc ivermectin đã làm giảm hiệu ứng “efflux” của TCBZ và TCBZ.SO trên những con sán kháng TCBZ-R so với các con sán nhạy (Mottier và cs., 2008).

Ngược lại, thuốc ivermectin không ảnh hưởng lên sự hấp thu của albendazole đối với các chủng sán nhạy và sán kháng (Mottier và cs., 2008). Giải trình tự của sự ức chế Pgp trên các chủng sán kháng cũng đã nghiên cứu dựa trên hình thái học riêng biệt so sánh với các chất ức chế Pgp khác. Cùng ủ R (+)- verapamil + TCBZ.SO dẫn đến tổn thương nghiêm trọng vỏ của các con sán kháng TCBZ (hình 5 và hình 6), ngược lại điều trị với TCBZ.SO (ngay cả với nồng độ cao) gây ra các thay đổi tối thiểu trên bề mặt của cấu trúc vi vỏ sán (Savage và cs.,2008). Sự hủy hoại cấu trúc vỏ sán giữa các sán nhạy và sán kháng sau khi điều trị bằng TCBZ.SO cũng được so sánh mô tả (Stitt và Fairweather, 1993). Trong khi có sự thay đổi của hoạt động bơm “efflux” có thể là một cơ chế không đặc hiệu, song điều đó có thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phát triển đến kháng thuốc.

Việc xác định và định vị những bơm ngược dòng liên kết Pgp vẫn chưa được làm sáng tỏ. các nghiên cứu gần đây đã ứng dụng một protocol liên quan đến vi giải phẩu laser (laser microdissection) đã cung cấp một lượng nhỏ mô sán đặc hiệu cho việc định vị Pgp. Vỏ, ruột và cấu trúc cơ quan sinh sản đã được phân lập và được thăm dò với các mồi đặc hiệu cho Pgp (Pgpspecific primer). Kết quả vẫn chưa kết luận cuối cùng và cần nhiều mẫu bệnh phẩm hơn nữa để làm sáng tỏ. Liên đới đến vai trò ơ chế chuyển hóa thuốc bị thay đổi ở những ca kháng TCBZ, cho biết tiến trình sulphoxide hóa thuốc TCBZ thành dẫn chất TCBZ.SO và từ TCBZ.SO thành hoạt chất Sulphone (TCBZ.SO₂) ở những dòng sán kháng lớn hơn so với dòng sán nhạy một cách ý nghĩa (Alvarez và cs., 2005; Robinson và cs., 2004). Ngoài ra, các dòng sán kháng TCBZ có khả năng chuyển hóa các phân tử đầu tiên cao hơn 39% (Alvarez và cs., 2005). Việc sử dụng các chất ức chế cho thấy rằng hệ thống enzyme flavin-monooxygenase (FMO) là con đường chính để chuyển hóa TCBZ và quan trọng hơn cả quy trình chuyển hóa của hệ thống enzyme cytochrome P450 (Alvarez và cs., 2005). Hơn nữa, methimazole (MTZ, một chất ức chế FMO) có tác động ức chế lên trên sự sulphoxide hóa của TCBZ của các dòng sán kháng cao hơn dòng sán nhạy (43% so với 34%). Thông qua so sánh, chất ức chế với hệ cytochrome P450, piperonyl butoxide đã làm giảm hình thành TCBZ. SO và kém hơn 12% trong 2 phân lập (Alvarez và cs., 2005).

NGHIÊN CỨU KHÁNG THUỐC TCBZ QUA KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PROTEIN HỌC

Nghiên cứu về proteine học liên quan đến ký sinh trùng trong thực nghiệm lần đầu tiên ấn bản cho biết có thể xác định những protein chủ yếu từ sán F. hepatica bằng kỹ thuật phổ khối (mass spectrometry) không cần dữ liệu bộ gen hoàn chỉnh (Jefferies và cs., 2001). Chương trình proteomic toàn cầu với sự hỗ trợ của dự án EST (Expressed Sequence Tag project) (www.sanger.ac.uk/Projects/ _mansoni/), đã xác định một số lượng protein có thể hòa tan sinh ra quá mức trong suốt quá trình các phân lập sán kháng TCBZ (phân lập Sligo) so với các phân lập sán nhạy TCBZ (Cullompton) khi phơi nhiễm / tiếp xúc với thuốc. Chẳng hạn, HSP-70 chỉ được sinh ra quá mức khi cho các con sán kháng phơi nhiễm với TCBZ.SO trên nuôi cấy. Các tế bào và protein này từ các sang chấn tế bào do gắn kết các protein biến tính từng phần và ngăn cản sự kết hợp, cho thấy cũng có cơ chế đáp ứng thuốc thuận chiều thành công trong những sán kháng TCBZ. Một thử nghiệm dựa trên proteine cho hệ thống khử độc chủ yếu pha 2, glutathione S-transferase (GST), trên các sán F. hepatica trưởng thành đã phát triển sử dụng 2 thể gốc gắn nhau và giải trình tự peptide MS-MS QTOF cũn sẽ cung cấp cho biết các tiếp cận dạng sub-proteomics để khảo sát mối liên quan của liên họ GST trên chuyển hóa TCBZ và đặc tính kháng.

Sự phát triển kháng với các thuốc giun sán của ký sinh trùng có thể dẫn đến giảm đi tính hiệu dụng, nhưng điều này không chứng minh được các ca có phân lập kháng TCBZ (Oberon). Chu trình đẻ trứng càng nhanh thì sinh sản ra cercariae càng nhiều, sinh sản cercariae càng nhiều và rõ ràng là các phân lập nhạy TCBZ (Fairhurst) (Walker và cs., 2006). Việc duy trì khả năng sinh sản có thể ngăn cản bất kỳ một sự đảo ngược nào liên quan đến tính nhạy của sán đối với thuốc-các số liệu thực địa đã chứng minh (Borgsteede và cs., 2005). Tình trạng mở thông nhanh các sán kháng TCBZ trên chuột trên cừu qua kết quả so sánh giữa phân lập Sligo (TCBZ-R) và phân lập Cullompton (TCBZ-S), các dữ liệu như thế rất cần thiết để thiết kế cũng như hoạch định các chương trình phòng chống sán hiệu quả.

BIỂU HIỆN TỔN THƯƠNG CẤU TRÚC VI VỎ GIỮA PHÂN LẬP SÁN KHÁNG VÀ NHẠY VỚI TCBZ QUA QUAN SÁT DƯỚI KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ

Không những dừng lại ở góc độ thử nghiệm phân tử, protein mà hiện các nhà khoa học cũng đã áp dụng các xét nghiệm hóa mô miễn dịch (Immunocytochemistry), xem cấu trúc đại thể cũng như sự thay đổi bề mặt vi vỏ của sán dựa trên kính hiển vi điện tử quyét (SEM_Scanning Electron Microscopy), hoặc chi tiết hơn là xem xét các thay đổi về mặt vi thể, nhất là biến đổi trong bộ golgi và hệ ty thể mitochondria qua quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền (TEM_Transmission Electron Microscopy). Những con sán non kháng thuốc triclabendazole loại Fasciola hepatica, được cho ủ trên in vitro với 10 μg/ml chất chuyển hóa sulphoxide của một thuốc diệt sán là alpha [5-chloro-2-methylthio-6-(1-naphthyloxy)-1H-benzimidazole], trong thời gian 6 và 18 giờ. Theo dõi diễn tiến điều trị, các mẫu sán được kiểm tra dưới kính SEM và TEM và làm hóa mô miễn dịch. Kết quả SEM cho thấy có sự phá hủy trực tiếp phần sau của sán, chủ yếu là các vùng sưng phồng và nổi bóng nước trên tổ chức vi vỏ, những biến đổi thương tổn này càng nghiêm trọng hơn nếu như thời gian ủ với thuốc kéo dài hơn 18 giờ. Cùng với kết quả trên, các hình ảnh qua quan sát dưới kính TEM cũng cho thấy sưng phồng các thể hạt sợi và gấp nếp lớp tế bào đáy nhiều lần. Ngoài ra, các tác giả còn ghi nhận cả thể tiết T₁ và T₂ đều giảm trong tổ chức liên kết hợp bào và tương bào sau 18 giờ cho xử lý thuốc. Những bó cơ tròn cũng bị gãy đoạn, hủy hoại, tổ chức sắp xếp các sợi cơ không đồng đều và số lượng sơi cơ giảm.

GHI NHẬN NHẠY-KHÁNG VỚI TCBZ TỪ CÁC PHÂN TÍCH HÓA MÔ MIỄN DỊCH

Để xác định cơ chế kháng với TCBZ, những con sán nhạy và kháng với TCBZđược làm thử nghiệm như sau: người ta ủ trên in vitro với triclabendazole sulphoxide (liều 50μg/ml). Quan sát dưới kính SEM và TEM cho thấy có tổn thương vỏ sán lan tỏa của các con sán F. hepatica nhạy với thuốc, ngược lại các sán kháng thuốc thì biểu hiện chỉ có vài tổn thương tương đối nhỏ và khu trú và chủ yếu tổn thương vùng quanh gai (spines).

Nghiên cứu hóa mô miễn dịch, sử dụng các kháng thể kháng tubuline cho biết tổ chức các vi ống của sán nhạy TCBZ bị hủy họai, tổn thương. Không có bằng chứng rõ ràng như thế trên các con sán kháng thuốc. Ý nghĩa của các thử nghiệm này giúp thảo luận rõ hơn cho cơ chế kháng TCBZ ở F.hepatica. Các dữ liệu qua nghiên cứu hóa miễn dịch tế bào cho thấy tổn thương không khác nhau có ý nghĩa với sự phân bố hoạt độ miễn dịch tubulin bên trong mô hợp bào vỏ sán, mô tương bào hoặc các tế bào liên quan vỏ. Kết quả chỉ ra chất alpha.SO có khả năng làm hủy hoại vỏ các con sán 4 tuần tuổi kháng với TCBZ một phần nào, mặc dù các thay đổi về hình thái học không liên quan đến bất kỳ sự khác biệt có ý nghĩa trong nhuộm miễm dịch ống tubulin.

Một nghiên cứu mới đâytập trung vào sự đáp ứng về mặt hình thái học của các phan lập sán Fasciola hepatica nhạy và kháng với TCBZ sau khi điều trị bằng nitroxynil (Trodax) cũng đã được ghi nhận các sán trưởng thành thuộc 3 phân lập nhạy khác nahu với TCBZ đem cho ủ trong 24 giờ với nitroxynil nồng độ 100 μg/ml. Sự thay đổi cấu trúc kín đáo ở vùng vỏ, dưới vỏ và hệ tiêu hóa sán được đánh giá qua kính TEM. Sự thay đổi tương tự nhau trên cả 3 phân lập, trên cấu trúc hợp bào vỏ sán, lớp đáy gấp nếp nhiều và cấu trúc ty thể hay sợi hạt bị phòng lên, tích dịch và tăng ly giải nhiều thể tiết ở chóp sán. Vùng gai bị phá hủy lan rộng, phức bộ golgi bị ảnh hưởng và giảm đi số lượng thể tiết T1 là một bằng chứng trong đáp ứng tế bào vỏ type 1. Vùng dưới vỏ, xuất hiện một khoảng không gian lớn giữa lớp mô và tế bào, biểu hiện một sự tiết dịch chiếm diện tích lớn. Sưng phồng ty thể và nhiều túi chứa dịch (cisternae) của hệ lưới nội mô cũng được tìm thấy bên trong lớp bì đường tiêu hóa cùng với nhiều thể tiết. Sự phá hủy lan rộng khi đáp ứng với thuốc khác nhau giữaa 3 phân lập, nhưng trên cả 3 phân lập đều thấy vỏ tổn thương nhiều hơn ruột (B. McKinstry và cs.,2008). Một nghiên cứu khác sử dụng Artemether để chống lại các sán kháng TCBZ cũng ghi nhận các hình ảnh tương tự (O'Neill JF và cs.,2008).

KẾT LUẬN

Rõ ràng, qua các dữ liệu cũng như các kết quả nghiên cứu dưới góc độ phân tử, miễn dịch, tế bào, hình thái học,... trong đánh giá cũng như xem xét cơ chế kháng thuốc TCBZ đến nay vẫn còn nhiều điều chưa thấu đáo, đôi khi ghi nhận ý kiến trái ngược nhau từ các tác giả. Về cơ bản, việc xác định các phân tử đích đối với tác động của TCBZ chưa được thiết lập đầy đủ, nếu cơ chế chủ yếu tập trung là tubuline thì vị trí gắn kết cần phải có đặc trưng quan trọng để cho bất kỳ sự đột biến nào trong isotype tubulin cũng có thể xác định được, nhưng ở đây chưa rõ ràng. Việc làm rõ cũng như chứng minh bằng các luận chứng khoa học vấn đề này sẽ mở ra một hướng mới để phát triển nhiều công cụ và thử nghiệm phân tử cải tiến hỗ trợ đánh giá tình trạng kháng thuốc TCBZ lan tràn trên thực địa hiện nay.

Một vài tiến bộ trong sử dụng kỹ thuật này cũng đã thực hiện với các bệnh nhiễm giun tròn khác (von Samson-Himmelstjerna, 2006). Từ khi người ta quan tâm đến cơ chế kháng thuốc TCBZ, nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc hấp thu thuốc và sự chuyển hóa thuốc đó bị thay đổi có thể là một mấu chốt quan trọng làm thay đổi điểm đích (gọi là tubulin). Giảm hấp thu thuốc, theo sau chuyển hóa thuốc càng nhanh à lượng thuốc TCBZ.SO đi đến được đích giảm đi đáng kể. Những tồn tại như thế rút ra bài học về cách nhận dạng cũng như biểu hiện của bơm “efflux” và vai trò của các con đường chuyển hóa thuốc. Điều quan trọng là khi thu nhận được các thông tin như thế có thể sẽ cho chúng ta biết được hoạt dộng điều chỉnh thuốc bên trong vật chủ thông qua sử dụng các chất ức chế thích hợp (Alvarez và cs., 2006). Ngược lại, điều này sẽ giúp duy trì hiệu lực của TCBZ trong quá trình đối mặt với phát triển kháng. Những gì trên đây đã cho chúng ta nhiều thông tin giá trị để tránh nguy cơ đối mặt với kháng thuốc. Tiếc thay, có quá nhiều nghiên cứu trên in vitro đã được tiến hành với các nồng độ thuốc quá cao cũng chưa giải thích rõ tính tương ứng trên in vivo. Ngay cả khi những ca biểu hiện điển hình, nhưng tác động thuốc cũng liên quan đến nhiều cơ chế khác nhau nhưng lệ thuộc nhau cũng chưa lý giải được (trên gia súc lẫn trên người). Do vậy, những nghiên cứu tập trung vào cơ chế kháng thuốc nên có bằng chứng chứ không nên dừng lại ở một ý niệm những gì “có thể” hoặc “có lẽ” và điều đó chỉ có thể đạt được thành công trong việc thiết lập bức tranh đầy đủ về kháng thuốc khi tiếp cận đến các thử nghiệm chi tiết và khoa học, khi đó mới hy vọng một cách toàn diện và tổng thể hơn.

Nghiên cứu cơ chế kháng thuốc TCBZ đã khó, tìm ra phác đồ chống kháng thuốc đơn thuần hay phối hợp thuốc lại càng khó hơn. Hiện tại, các nhà khoa học cũng đã thử nghiệm lâm sàng so sánh giữa phác đồ TCBZ đơn thuần với một số phác đồ TCBZ + Artemether, hoặc OZ78 + Artemether, ...kết quả cho thấy hiệu lực giảm lượng sán cao (95.3%-100%) trên thực nghiệm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Văn Chương, Triệu Nguyên Trung và cs., (2007). Hiệu lực điều trị và tính dung nạp của triclabendazole (TCBZ) trong điều trị các bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn F.gigantica và bước đầu sử dụng metronidazole chống kháng các trường hợp kháng TCBZ tại một số tỉnh MT-TN, Việt Nam (2004-2006). Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, Vol.11-phụ bản số 2: 117-126.

2.Phạm Văn Thân, Huỳnh Hồng Quang (2007). Đặc điểm sinh học và một số nét về dịch tễ họccủa bệnh sán lá gan do Fasciola hepatica and Fasciola gigantica ở người. Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, Vol.11-phụ bản số 2:15-23.

3.Triệu Nguyên Trung, Huỳnh Hồng Quang (2008). Cập nhật thông tin về định loại các loài sán lá gan trên thế giới từ phương pháp cổ điển đến hiện đại. Tạp chí y dược học quân sự, ISSN 1859-0748, Vol.33, số 2: 98-103.

4.Alvarez, A.I., Solana, H.D., Mottier et al., (2005). Altered drug influx/efflux and enhanced metabolic activity in triclabendazole-resistant liver flukes. Parasitology 131, 501–510.

5.G.P. Brennan, I. Fairweather, A. Trudgett, E. Hoey, McCoy et al., (2007). Understanding triclabendazole resistance. Experimental and Molecular Pathology 82 (2007) 104 - 109

6.Jefferies, J.R., Campbell, A.M., van Rossum, A., Barrett, J., Brophy, P.M (2001). Proteomic analysis of the excretory-secretory products of the digenean parasite Fasciola hepatica. Proteomics 1, 1128–1132.

7.J. Keiser, J. Utzinger, J. Vennerstrom, Y. Dong, G. Brennan, I. Fairweather (2008). Activity of artemether and OZ78 against triclabendazole-resistant Fasciola hepatica. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, Volume 101, Issue 12, Pages 1219-1222

8.McConville, M., Brennan, G.P., McCoy et al., (2006). Adult triclabendazole-resistant Fasciola hepatica: surface and subsurface tegumental responses to in vitro treatment with the sulphoxide metabolite of the experimental fasciolicide compound alpha. Parasitology 133, 195–208.

9.Robinson, M.W., Lawson, J., Trudgett, A., Hoey, E.M., Fairweather (2004). The comparative metabolism of triclabendazole sulphoxide by triclabendazole-susceptible and triclabendazole-resistant Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 92, 205–210.

10.B. McKinstry, L. Halferty, G.P. Brennan, I. Fairweather (2009). Morphological response of triclabendazole-susceptible and triclabendazole-resistant isolates of Fasciola hepatica to treatment in vitro with nitroxynil (Trodax). Parasitology Research, Vol.104, N₀ 3: 645-655.

SUMMARY

TRICLABENDAZOLE – RESISTANT FASCIOLA SPP. UNDER MOLECULAR ASPECTS: LITERATURE REVIEWS OF THE WORLD AND VIETNAM, AND UPDATES OF INFORMATIONS

Fascioliasis is old disease but very “hot-nouvel”or Reemergency. Triclabendazole (TCBZ) has been the drug of choice to treat liver fluke infections in livestock for over 20 years, due to its high activity against both adult and juvenile flukes. More recently, it has been used successfully to treat human cases of fascioliasis. However, parasite resistance against triclabendazole is spreading in the veterinary field, and there are no drugs of comparable activity currently available for the treatment and control of fascioliasis. Resistance to TCBZ first appeared in the field in Australia in the mid-1990s. Since then, resistance has been reported from a number of countries throughout Europe: Ireland, Scotland, Wales, Spain and The Netherlands. Up to now, it seem to be no confirmedcasesof TCBZ resistancehavebeendocumentedinhumansbut many case had reduced sensitivity to TCBZ in clinical practice.The heavy reliance o­n a single drug puts treatment strategies for fascioliasis at risk. Should resistance develop further, the prospect is an alarming o­ne. This review will present an overview of progress in understanding the mechanism of resistance to TCBZ, examining possible changes in the target molecule, in drug influx/efflux mechanisms and in the metabolism of TCBZ by the fluke. The review will also consider ways to deal with resistance, covering drug-oriented options such as: the use of alternative drugs, drug combinations and the search for new compounds. Finally, It is clear that our understanding of the mechanism of resistance to TCBZ remains far from complete, need to be more studies and apply of advanced tools.

Các nội dung khác »

---

• Kỹ thuật mới có thể phát hiện nhanh biến đổi gen bên trong ký sinh trùng sốt rét tại thực địa (06/03/2024)
• Giải trình tự thế hệ mới góp phần làm sáng tỏ một số bệnh truyền nhiễm (11/08/2023)
• Cập nhật về nghiên cứu một số vaccine phòng bệnh sốt rét (23/06/2023)
• Tính sinh miễn dịch của hai ứng viên vaccine sốt rét hàng đầu được cung cấp dưới dạng vaccine mrna-lnp (03/04/2023)
• Thêm một kỹ thuật sinh học phân tử mới giúp tăng tốc loại trừ sốt rét và nghiên cứu một số lĩnh vực y sinh khác (20/06/2022)
• Cần thận trọng vì kháng thể đơn dòng evusheld không phải “siêu vaccine” chống lại COVID-19 (Evusheld (tixagevimab + cilgavimab) for Pre-exposure Prophylaxis (PrEP) of COVID-19) (21/03/2022)
• Cán bộ nhân viên Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn thực hiện xét nghiệm SARS-CoV-2 cho các tỉnh miền Trung-Tây Nguyên chung tay phòng, chống dịch bệnh COVID-19 (21/07/2021)
• Mất gen Pf-HRP2/3 và ký sinh trùng kháng thuốc là hai trong ba mối đe dọa sinh học trong cuộc chiến chống lại bệnh sốt rét trên toàn cầu (17/06/2020)
• Ứng dụng phương pháp phân tử loop-mediated isothermal amplification (LAMP) trong phát hiện chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn Fasciola spp. (04/06/2019)
• Một số phương pháp kỹ thuật áp dụng trong phát hiện chẩn đoán sốt rét (20/05/2019)
• Nghiên cứu ứng dụng quan kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán và phát hiện các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm (24/10/2018)
• Ký sinh trùng sốt rét ở châu Mỹ đa dạng về mặt di truyền học nhiều hơn so với suy nghĩ trước đây (14/05/2018)
• Cứ hai phút có một đứa trẻ chết vì sốt rét và hiện tại muỗi đang trở nên đề kháng với thuốc diệt côn trùng (03/01/2018)
• Một bước tiến gần hơn đến việc sản xuất ra một vaccine DNA chống lại virus sốt xuất huyết Dengue (25/07/2017)
• Loài muỗi Aedes aegypti gây nhiễm Chikungunya lần đầu tiên được phát hiện ở Brazil (23/06/2017)