 |
| Tai labo sinh học phân tử |
Một số ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong bệnh lý vi sinh học và ký sinh trùng học
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp, cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen". PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.Trong vi sinh vật, phản ứng khuyếch đại DNA hay gọi là PCR (Polymerase Chain Reaction) được ứng dụng rất sớm và ngày càng rộng rãi để chẩn đoán cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, ký sinh trùng và virus, để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của chúng và để phân loại chúng một cách chi tiết và chính xác hơn. Phương pháp cơ bản chạy kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10.1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase. DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung. Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96°C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR. Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110°C. DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA. Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn. Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA. Do kỹ thuật và phản ứng PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí nghiệm và điều kiện làm việc thực hiện các phản ứng. Vì vậy, các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA, ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong một khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pippette. Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA khác. Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn được thực hiện để kiểm tra sự tạp nhiễm. 1. Xác định cǎn nguyên của bệnh nhiễm trùng Cǎn cứ vào các đặc điểm thường gặp nhất của vi sinh vật được quan tâm, người ta tìm đến các gen quyết định các tính trạng đó, thiết kế một mồi phù hợp nhằm để khuyếch đại một vùng ổn định nào đó trên bộ gen. Sản phẩm của quá trình khuyếch đại sau này, vì vậy, đã được xác định (cả về độ dài và trình tự các nucleotide) ngay từ giai đoạn này. Khi đưa gen mồi nói trên vào một hỗn hợp ADN đã được tách chiết từ vi sinh vật, nếu ADN này có chứa các đoạn gen có trình tự các nucleotide bổ sung với trình tự của gen mồi thì chúng sẽ cặp đôi với nhau theo nguyên tắc và sau đó gen mồi được kéo dài về phía đầu 3' của nó nhờ enzyme ADN polymerase. Đoạn ADN đó nhờ vậy sẽ được nhân lên một cách đặc hiệu rất nhiều lần. Sau quá trình nhân lên, người ta sẽ tìm đoạn DNA này, thông thường nhất, bằng điện di trên gel agarose và nhuộm bằng Ethidium bromide. Như vậy, sau khi điện di, nếu có bǎng ADN chạy giống như bǎng chuẩn thì điều đó có nghĩa là có vi sinh vật cần tìm trong bệnh phẩm; ngược lại, nếu không thấy bǎng (band) nào xuất hiện hoặc có những bǎng không giống với bǎng chuẩn thì có nghĩa là không có tác nhân gây bệnh cần tìm trong bệnh phẩm. Dựa trên nguyên tắc này, hiện nay, hầu như tất cả vi sinh vật gây bệnh đều có thể tìm được nhờ phản ứng PCR. Sau đây là một số ứng dụng điển hình: 1.1.Dùng PCR cho vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất khó -Tác nhân vi khuẩn gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn chưa nuôi cấy trong môi trường nhân tạo được. Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm cho phản ứng PCR. Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn đoán rất sớm. Người ta cũng đã dùng PCR để tìm gen mã hoá cho protein màng ngoài hoặc một đoạn 419-bp của gen mã hoá protein lông của các tác nhân gây bệnh Lyme (Borrelia burgdorferi). Qua đó, bệnh Lyme có thể được chẩn đoán sớm và chính xác. -Tác nhân gây bệnh đường sinh dục: vi khuẩn lậu và các viêm niệu đạo do lậu khó nuôi cấy. Neisseria gonorrhoeae và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau lậu (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma genitalium) đã có thể đồng thời tìm được trong một ống PCR duy nhất với bệnh phẩm là nước tiểu. Điều này không những mang lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân mà còn góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình bệnh một cách sát thực hơn, do trước đây không có điều kiện nuôi cấy tìm cǎn nguyên gây bệnh. -Vi khuẩn lao: Mycobacterium tuberculosis không phải là quá khó nuôi cấy, song chúng mọc rất chậm (thời gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E. coli, khoảng 20 phút). Khoảng 2 tháng sau khi nuôi cấy mới nhìn thấy khuẩn lạc lao. Vì vậy, giá trị lâm sàng của phương pháp nuôi cấy bị hạn chế rất nhiều. Phương pháp nhuộm soi từ bệnh phẩm thì có độ nhạy rất kém (phải có trên 105 vi khuẩn/ ml đờm mới cho kết quả dương tính). PCR đã góp phần giải quyết việc này, nó có thể cho kết quả trong vòng 1 - 2 ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương pháp cổ điển. Vì vậy, có thể chứng minh được sự có mặt của vi khuẩn lao trong dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà trước đây chẩn đoán rất khó khǎn; -PCR để xác định các đột biến kháng Rifamicin (dấu hiệu rất có giá trị để xác định một M. tuberculosis là đa đề kháng) ở gen rpoB. Nhờ vậy, những biện pháp điều trị phù hợp được áp dụng một cách kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân và cộng đồng, vì rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã được hạn chế tung ra môi trường bên ngoài. -Vi khuẩn trong dạ dày Helicobacter pylori: H.P hiện đang là một trong những vấn đề thời sự của y học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý viêm, loét và ung thư dạ dày được quan tâm gần đây. Tuy vậy, nuôi cấy HP rất khó, PCR đã được dùng để tìm HP trực tiếp từ mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen (VacA, CagA) liên quan tới độc tính của nó. Nhờ PCR, người ta còn biết được sự phân bố của các chủng HP khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định. -Các vi khuẩn khác như Coxiella burnetti với mảnh 438-bp của gen mã hoá cho một protein 27kDa của màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp mã hoá cho protein lông và 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi; Pseudomonas pseudomallei (hay Burkholderia pseudomallei) với mảnh 517-bp của 16S ARNr cũng đã được khuyếch đại thành công bằng PCR. -Xác định độc tố của vi sinh vật: tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (Enterofoxigenic Escherichia Coli_ ETEC); vt1 và vt2 của E. coli gây chảy máu đường ruột (Enterohemorrhagic Escherichia coli_EHEC); eaeA và bfpA của E. côli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic Escherichia coli_ EPEC); ial của E.coli xâm nhập đường ruột (Enteroinvasive Escherichia coli_EIEC) và Shigella đã được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại Escherichia coli gây tiêu chảy. -Xác định vi khuẩn ngoài môi trường: các vi khuẩn khó nuôi cấy và / hoặc thường có mặt ngoài môi trường có thể được tìm trực tiếp bằng PCR, như các Legionella, Salmonella, Shigella và Vibrio cholerae. Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh đã được áp dụng rất rộng rãi. PCR có lợi thế lớn là nhanh (thời gian cần thiết cho chẩn đoán tính bằng "giờ" so với các kỹ thuật kinh điển phải tính bằng "ngày"), nhạy (độ nhạy rất cao, chỉ cần từ 10 - 1000 tế bào vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, là đủ) và độ đặc hiệu cũng rất cao. Nhờ vậy, bệnh được chẩn đoán nhanh hơn và chính xác hơn. Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn, tốn kém; hoặc kết quả nuôi cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống. Tuy vậy, cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ thuật phải có trình độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán kinh điển khác. 2. Định loại vi khuẩn Sau khi phân lập được vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng trong định loại chúng. -Đối với từng vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm là vi khuẩn thuần. Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn thuần cho PCR rất đơn giản: chỉ cần đun sôi cách thuỷ huyền dịch vi khuẩn trong 10 phút rồi thu lấy dịch nổi sau ly tâm loại bỏ tế bào là đủ. -Nhờ khuyếch đại những đoạn gen phụ trách ARNr 16S, người ta có thể so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa nhau giữa các vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết hơn và chính xác hơn. 1.2. Đơn bào Amíp -Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Mdal liên quan tới độc tính của Entamoeba histolytica, người ta có thể phân biệt được amíp gây bệnh và amíp không gây bệnh; -PCR phát hiện tác nhân Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii trong phân từ Sydney, Úc do nhóm các nhà nghiên cứu R. Fotedar, D. Stark, N. Beebe, D. Marriott, J. Ellis, J. Harkness đang công tác tại khoa vi trùng, bệnh viện St. Vincent's, Sydney, Australia, Viện Công nghệ sinh học của bệnh truyền nhiễm, đại học Kỹ thuật Sydney, Broadway, Australia, Khoa khoa học sinh học và y học, đại học Sydney, Broadway, Australia cùng tiến hành cho biết nghiên cứu của họ nhằm tiến hành xem xét sự có mặt của Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii trong các mẫu phân tren bệnh nhân ở Sydney, Australia. Các mẫu phân được xét nghiệm bằng cả kính hiển vi và PCR. 5 bệnh nhân tìm thấy E. histolytica, trong khi E. dispar và E. moshkovskii tìm thấy lần lượt trên 63 (70.8%) và 55 (61.8%) bệnh nhân bằng PCR. Đây là nghiên cứu đầu tiên của Australia sử dụng kỹ thuật phân tử để xác định sự có mặt của E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii; -Phân biệt Entamoeba histolytica / Entamoeba dispar bằng kỹ thuật PCR và liên uqan đến miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể trên những cá nhân có triệu chứng lâm sàng nhiễm a míp khác nhau. Đây là công trình nghiên cứu của nhóm tác giả Sánchez-Guillén Mdel C, Pérez - Fuentes R, Salgado - Rosas H, Ruiz - Argüelles A, Ackers J, Shire A, Talamas-Rohana P. làm việc tại khoa ký sinh trùng, trung tâm y sinh học Oriente, IMSS, Puebla, México. Kết quả cho biết họ đã sử dụng kỹ thuật colorimetric PCR để phân biệt E. histolytica với E. dispar trên các cá nhân nhiễm bệnh amip và liên quan đến dữ liệu lâm sàng và các đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào với amip. Kết quả cũng đã chỉ ra nồng đọ kháng thể cao trong nhiễm amip cấp và tăng sự sinh IL-4 , một loại cytokine liên quan đến Th2, liên quan E. histolytica. Trong bệnh amip mạn tính, ngay cả khi huyết thanh chống amip dương tính, các triệu chứng tiêu hóa liên quan đến E. dispar trong tất cả bênh nhân, không có sự khác biệt mức độ kháng thể BTI, CD4+/CD8+, INF-gamma, IL-4. Trong số những người mang trùng không triệu chứng, E. dispar trường tìm thấy hơn. Tuy nhiên, việc xác định E. histolytica trên 2 người mang trùng không triệu chứng liên quan với nồng độ INF-gamma cao, một loại cytokine liên quan đến Th1, chỉ ra tầm quan trọng của chẩn đoán đặc hiệu cho Entamoeba spp., để thiết lập đặc ddiemr lâm sàng và dịch tễ học cả amip đường ruột và amip ngoài ruột. -Ứng dụng kỹ thuật Real-Time-PCR chẩn đoán Entamoeba histolytica do nhóm tác giả Shantanu Roy, Mamun Kabir, Dinesh Mondal, Ibne Karim M. Ali, William A. Petri Jr. vaf Rashidul Haque thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh tiêu chảy quốc tế, Bangladesh (ICDDR,B), Dhaka, Bangladesh, Đại học y tế nhiệt đới và Vệ sinh London, Anh, khoa y, vi sinh và bệnh học của đại học Virginia, Charlottesville, Virginia nghiên cứu cho biết họ đã triển khai một kỹ thuật real-time-PCR sử dụng đầu dò beacon probe phân tử để phát hiện Entamoeba histolytica và so sánh độ nhạu với kỹ thuật xét nghiệm phát hiện kháng nguyên trong phân với kỹ thuật PCR cổ điển. Tổng số 205 mẫu phân và mẫu mủ của abces gan và các bệnh nhân làm nhóm chứng nghiên cứu này, 101 (49%) dương tính bởi kỹ thuật phát hiện kháng nguyên đặc hiệu E. histolytica, trong khi đó 104 (51%) trường hợp mẫu phân khác và mủ âm tinh với kỹ thuật phát hiện kháng nguyên. DNA được tách chiết từ phân và mủ của ổ abces theo phương pháp của hãng QIAGEN và small-subunit rRNA gene của E. histolytica, rồi khuyêch đại như kinh điển và làm theo real-time PCR. Trong số 205 mẫu phân và mủ từ ổ abces, có đến 124 mẫu dương tính bằng kỹ thuật real-time-PCR và 90 mẫu dương tính bằng PCR cổ điển. So sánh với real-time-PCR, kỹ thuật phát hiện kháng nguyên có độ nhạy là 79% và độ đặc hiệu là 96%. Khi dùng kỹ thuật PCR kinh điển so với real-time-PCR, độ nhạy của PCR kinh điển là 72% và độ đặc hiệu là 99%. Kết quả trên cho thấy cả 3 phương pháp phát hiện E. histolytica đều có độ đặc hiệu cao và kỹ thuật real-time PCR cho độ nhạy cao nhất. -Một nghiên cứu khác cũng tiến hành nhằm so sánh kỹ thuật PCR với phương pháp phát hiện kháng nguyên để chẩn đoán Entamoeba histolytica do nhóm tác giả S J Furrows, A H Moody, P L Chiodini thuộc khoa vi trùng, Cecil Fleming House, đại học London, Grafton Way, London WC1H, Anh tiến hànhtheo phương pháp ELISA và PCR - SHELA (, polymerase chain reaction solution hybridisation enzyme linked immunoassay) so sánh trên 101 mẫu phân. Kết quả cho thấy 15/101 mẫu phân dương tính vớiE. histolytica bằng một hay nhiều phương pháp. Sự trái ngược kết quả giữa 2 phương pháp trong 5/15 mẫu này. 1.3. Virus -Vi rút viêm gan B, HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã được chẩn đoán thành công bằng PCR. Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy, PCR cho kết quả dương tính sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch từ 3 - 6 tháng; đặc biệt là nó cho phép chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc này, có thể, chỉ đơn thuần là do từ mẹ truyền sang. -PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn. -Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT), (CT, cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG). -Clostridium difficile đã được định loại thông qua xác định các loại độc tố riêng biệt của chúng bằng PCR. 2.Ứng dụng sinh học phân tử trong các bệnh ký sinh trùng Trong lĩnh vực bệnh lý do ký sinh trùng, sinh học phân tử góp phần không nhỏ vào công tác phát hiện, chẩn đoán, giám định, phân loại nhiều loại ký sinh trùng, đặc biệt là giun sán và sốt rét. Mặc dù kiểu hình trong phân loại là rất thông dụng và đã có những thành tựu hết sức quan trọng, nhưng đôi khi rất khó phân biệt loài và dưới loài một cách chính xác (McCarthya, Moore, 2000). Nên khi đó vai trò của sinh học phân tử hay nói đúng hợn là các công cụ phân tử rất hữu ích và xác định rạch ròi chính xác. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống áp dụng trong lâm sàng và dịch tễ học như xét nghiệm tìm trứng/ấu trùng hay các sản phẩm của ký sinh trùng hoặc các kỹ thuật miễn dịch học đều có những sai số nhất định, tuỳ từng loài ký sinh trùng, đặc biệt khi các dạng ký sinh trùng cùng tồn tại ở một nơi như ở hệ tiêu hóa, chất thải ở hệ hô hấp hay máu của hệ tuần hoàn. Phương pháp sinh học phân tử nhân bản DNA và phân tích đặc tính sản phẩm thu được, đặc biệt là phân tích biến đổi gen/hệ gen được ứng dụng trong chẩn đoán phân loại và lập phả hệ sinh vật, đã bước đầu chứng minh cho kết quả chính xác hơn nhiều so với phương pháp truyền thống (Elnifro et al., 2000; De Lellis et al., 2008; Mori và Notomi, 2009). Các số liệu chính xác của các phương pháp sinh học phân tử đã cho phép ứng dụng những hướng mới và rất có thể sẽ làm thay đổi một phần hệ thống phân loại và chẩn đoán phân biệt loài hiện có (Galluzzi et al., 2007; Littlewood, 2008). Trong hai thập kỹ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới đã có những định hướng phát triển vượt bậc. Một trong những thành tựu lớn của nhân loại là sự phát triển phương pháp nhân bản DNA bằng kỹ thuật đa mồi (multiplexing methodology), đặc biệt những phương pháp nhân bản DNA sử dụng nhiều mồi cùng một lúc phát hiện đa khuôn đó là kỹ thuật multiplex-PCR (multiplex polymerase chain reaction) tạo sản phẩm DNA mạch thẳng (Powledge, 2004; Ishmael, Stellato, 2008) và kỹ thuật LAMP (loop-mediated isothermal amplification) đa mồi nhân bản DNA phát hiện đơn khuôn, tạo sản phẩm DNA cấu trúc vòm (Gill, Ghaemi, 2008; Parida et al., 2008; Mori, Notomi, 2009). Nếu sử dụng RNA làm khuôn, sau khi chuyển đổi sang DNA bằng phản ứng sao chép ngược (reverse transcription), cả PCR và LAMP cũng đều có thể thực hiện quá trình tổng hợp chuỗi nucleotide cho sản phẩm DNA. Do vậy, bên cạnh PCR sử dụng khuôn DNA, còn có RT-PCR sử dụng khuôn RNA; và bên cạnh LAMP sử dụng khuôn DNA, còn có RT-LAMP sử dụng khuôn RNA (Goto et al., 2007; Parida et al., 2008). Cả hai phương pháp PCR/RT-PCR và LAMP/RT-LAMP đều sử dụng cùng lúc nhiều mồi (từ 2 mồi trở lên); sử dụng DNA hay RNA làm khuôn cung cấp vùng gen đích; sử dụng các dẫn chất deoxy-nucleotide triphosphate (dNTP) làm nguyên liệu kiến tạo; sử dụng một loại DNA polymerase làm enzyme để xúc tác tổng hợp chuỗi nucleotide; sử dụng các thành phần làm phụ trợ cho phản ứng hoạt động trong đó có i-on Mg++ có vai trò quan trọng; và xác nhận kết quả bằng cách đánh giá sự hiển thị của sản phẩm DNA trong điều kiện thích hợp. PCR được ứng dụng cho giám định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh vật, trong đó có ký sinh trùng (Chandler và Colitz, 2006; Littlewood, 2008) và trở thành một công cụ không thể thiếu được trong công tác giám định, phát hiên sinh vật (kể cả ký sinh trùng) gây bệnh bằng kỹ thuật cao. Dễ làm, có tính nhạy và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một lượng rất ít khuôn DNA của đối tượng sinh vật bất kể giai đoạn sinh trưởng nào, PCR đã có thể cho sản phẩm với độ chính xác cao về loại sinh vật cần nghiên cứu. Với lợi thế như vậy, PCR đã thực sự được ứng dụng rộng rãi trong mọi lĩnh vực, trước hết là chẩn đoán phân tử xác định và phân biệt các loài gây bệnh (Ishmael và Stellato, 2008). PCR đa mồi (multiplex-PCR) trong chẩn đoán phân tử xác định và phân biệt ký sinh trùng Đối với ký sinh trùng, cho đến nay đã có hàng chục phương pháp và kit chẩn đoán multiplex-PCR sử dụng phát hiện nhiều loài gây bệnh. Khi ký sinh trùng cùng tồn tại ở một vị trí, một vùng trong cơ quan của cơ thể (ví dụ: cùng ở trong máu, cùng ở trong đường ruột/khoang ruột, cùng ở trong phổi/dịch phổi, hoặc metacercariae cùng ở trong một vật chủ trung gian), thì việc cùng lúc phát hiện và phân biệt được nhiều loài gây bệnh mang lại tính kinh tế và lợi ích cao hơn nhiều so với thực hiện đơn lẻ (Edwards, Gibbs, 1994; De Lellis et al., 2008). Multiplex-PCR đã được xây dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt các loài sán lá/sán dây, bao gồm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini (Le et al., 2006); sán lá gan lớn F. hepatica từ ốc vật chủ trung gian (Magalhães et al., 2004; 2008); sán lá phổi Paragonimus spp (Sugiyama et al., 2006; Le et al., 2006); sán dây Taenia saginata, Taenia solium, Taenia saginata asiatica và ấu trùng sán lợn (González et al., 2000; 2004; Yamasaki et al., 2004; Trachsel et al., 2007); sán chó Echinococcus multilocularis (Davidson et al., 2009). Multiplex-PCR cũng được sử dụng phát hiện và phân biệt các loại giun tròn (nematode) trong đó có Trichinella và nematode đường ruột (Zarlenga et al., 1999; 2001a,b); phân biệt Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Oesophagostomum bifurcum (Verweij et al., 2007) hoặc các loài Oesophagostomum spp ở lợn (Lin et al., 2008); phát hiện và phân biệt Brugia malayi và Wuchereria bancrofti với nhau (Mishra et al., 2007) và với ký sinh trùng sốt rét (Rao et al., 2009); Multiplex-PCR tỏ ra sử dụng rất hữu hiệu chẩn đoán phân biệt nhiều nhóm ký sinh trùng đơn bào (protozoa), chủ yếu tập trung vào nhóm ký sinh trùng đơn bào đường ruột như Cryptosporidium và Giardia (Patel et al., 1999; Gile et al., 2002; Guy et al., 2003); Cyclospora và Eimeria (Orlandi et al., 2003; Fernandez et al., 2003); đặc biệt là ký sinh trùng đơn bào máu, chủ yếu tập trung ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp, trước hết là phân biệt 4 loài gây bệnh, chủ yếu ở người, đó là Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale, theo từng nhóm hoặc cả 4 loại từ máu (Padley et al., 2003; Patsoula et al., 2003; Rougemont et al., 2004; Veiga et al., 2006; Rao et al., 2009); hoặc từ vector là muỗi Anopheles (Lardeux et al., 2008). Một loại ký sinh trùng khác thường có trong máu là Leishmania spp cũng được chẩn đoán phân biệt bằng multiplex-PCR từ máu, dưới da hay từ nguồn truyền lây vector là loài muỗi cát Lutzomyia (Harris et al., 1999; Jorquera et al., 2005; Rodríguez-González et al., 2007; de Pita-Pereira et al., 2008) hayký sinh trùng đường máu lê dạng trùngBabesia caballi và Babesia equi ở động vật (Alhassan et al., 2005) hoặc các loài đơn bào máu khác cũng được phát hiện bằng multiplex-PCR trong đó có Toxoplasma gondii (Ajzenberg et al., 2005; Nowakowska et al., 2006). Multiplex-PCR còn được ứng dụng chẩn đoán lỵ amíp do khả năng phát hiện nhanh, chính xác phân biệt các loài gây bệnh với nhiều loài khác có hình thái tương tự, trước hết là Entamoeba histolytica và Entamoeba dispar từ phân người bệnh (Evangelopoulos et al., 2000; Haque et al., 2007; Khairnar, Parija, 2007). Về vùng gen đích chọn lựa sử dụng chẩn đoán, nhiều tác giả khai thác hệ gen nhân tế bào trong đó hướng tới đối tượng gen 18S rRNA phân biệt cầu trùng Eimeriavới Cyclospora(Orlandi et al., 2003), giám định và phân biệt các loài Cryptosporidium (Patel et al., 1999), phát hiện các loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium (Rougemont et al., 2004); hay đối tượng là gen pfcrt, pfmdr1, pfdhfr ở ký sinh trùng sốt rét (Veiga et al., 2006) và nhiều vùng gen hay vùng giao gen khác. Nhiều công trìnhkhai thác đích là hệ gen ty thể (mitochondrial genome), ví dụ chẩn đoán phân biệt sán dây Taenia spp (Trachsel et al., 2007; Yamasaki et al., 2004; 2006); sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini (Le et al., 2006); sán lá gan lớn Fasciola hepatica (Magalhães et al., 2004; 2008); phân biệt định loài động vật trong thức ăn thực phẩm (Ono et al., 2007). Hướng sử dụng hệ gen ty thể trong nghiên cứu chẩn đoán loài kể cả ứng dụng multiplex-PCR được coi là có cơ sở vững vàng trong điều kiện hiện nay. Do có kích thước nhỏ, tồn tại nhiều bản sao trong một tế bào (vài trăm/tế bào), cấu trúc là vòng DNA khép kín nên rất bền vững, cấu trúc đơn gen liên tục thuận lợi cho PCR hoạt động, một tế bào cho nguồn khuôn DNA gấp hàng trăm lần so với hệ gen nhân nên phản ứng PCR có độ nhạy cao hơn (Le et al., 2002; Hu, Gasser, 2006). Điều này có ý nghĩa khi sử dụng tế bào trứng giun sán làm nguồn khuôn cho multiplex-PCR, vì chỉ cần 1 tế bào trứng đã cho hàng trăm phân tử DNA hệ gen ty thể. Nhiều công trình đã thiết kế multiplex-PCR chỉ sử dụng trứng giun/sán cung cấp nguồn khuôn DNA để tận dụng tính đơn giản thu mẫu (chỉ cần phân người bệnh, đối với nhiều ký sinh trùng phủ tạng và đường ruột; hay đờm chất dịch hô hấp, đối với sán lá phổi) (Trachsel et al., 2007; Davidson et al., 2008). Gen/hệ gen ty thể của nhiều loài ký sinh trùng đã lần lượt được giải mã và đăng ký trong Ngân hàng gen thế giới, tạo cơ sở dữ liệu để có thể truy cập ứng dụng trong việc thiết kế mồi đặc hiệu từng loài cho multiplex-PCR và so sánh phân biệt trong chẩn đoán, giám định và phân loại (Le et al., 2002; Hu, Gasser, 2006). Có hàng ngàn hệ gen ty thể đã được giải trình tự và phân tích hoàn toàn, hàng trăm hệ gen ty thể khác đang từng phần được giải quyết, bao gồm tất cả mọi loài quan trọng từ bậc thấp đến bậc cao, từ động vật đơn bào đến động vật đa bào, cung cấp một hệ thống dữ liệu quan trọng cho các quá trình nghiên cứu gen, protein, tiến hoá, lịch sử tiến hoá, di truyền quần thể, quan hệ về loài, giống và nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng khác, trong đó có sử dụng dữ liệu để thiết kế mồi cho multiplex PCR. Ngoài ra còn có thể sử dụng các gen đích của hệ gen nhân trong chiến lược thiết kế phương pháp PCR đa gen/đa mồi để chẩn đoán phân biệt. Nghiên cứu ứng dụng PCR đa mồi xác định và phân biệt ký sinh trùng tại Việt Nam Nghiên cứu về sinh học phân tử giám định thành phần loài và chẩn đoán phân biệt các loài giun/sán ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể đã được một số tác giả thực hiện có hiệu quả, đặc biệt trong 10 năm gần đây. Có hàng trăm công trình sử dụng PCR đa mồi trong chẩn đoán phân biệt ký sinh trùng được đăng tải phản ánh định hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật cao đối với lĩnh vực ký sinh trùng, mà chúng tôi không có ý định nêu hết trong bài tổng quan này, chỉ điểm qua một số kết quả do nhóm chúng tôi thực hiện được. Trước hết, đó là nghiên cứu xác định loài sán dây châu Á Taenia asiatica đầu tiên ở Việt Nam (Lê Thanh Hòa và cs, 2002; Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà, 2006). Sau đó các loài sán khác lần lượt đã được thẩm định thành phần loài như: sán lá gan nhỏ C. sinensis, sán lá ruột Fasciolopsis buski, sán lá gan lớn Fasciola gigantica, sán lá phổiParagonimus heterotremus, P. vietnamensis, P. proliferus (Le và cs, 2006; Doanh và cs, 2007; 2008; 2009); sán dây T. saginata, T. solium ký sinh trên người, ấu trùng sán dây lợn trên lợn và trên người cũng đã được thẩm định bằng sinh học phân tử hệ gen ty thể (Lê Thanh Hoà và cs, 2002; Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà, 2006) và lần lượt một số chuỗi gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen thế giới. Những kết quả bước đầu này đã góp phần giải quyết một số vấn đề trong xác định thành phần loài giun sán tại Việt Nam và đã làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu kit multiplex PCR để chẩn đoán xác định bệnh giun sán. Đồng thời đó cũng là cơ sở dữ liệu quý báu cho khoa học trong nghiên cứu đa dạng sinh học và đóng góp vào hoạch định chiến lược phòng chống giun sán có hiệu quả ở Việt Nam. Cho đến nay, nghiên cứu sinh học phân tử trong chẩn đoán ký sinh trùng mới thực hiện ở góc độ đơn loài, kit PCR đơn gen, mà chưa có những định hướng tổng thể sàng lọc, xây dựng kit đa gen (multiplex-PCR) cho một nhóm cùng loài, hay cho một hỗn hợp các loài cùng tồn tại trên người ở những vị trí phân bố cần chẩn đoán (Lê Thanh Hoà, 2007). Tuỳ theo khu trú hỗn hợp của các loài ký sinh trùng gây bệnh, chúng tôi mong muốn chọn lọc phân nhóm loài đối tượng, hoặc/và phân vùng khu trú (ruột, lấy mẫu phân; phổi, lấy mẫu đờm, dịch tiết phổi), xây dựng kit song gen (duplex-PCR), đa gen (multiplex-PCR) để chẩn đoán sàng lọc và giám định và đó cũng chính là những định hướng xuyên suốt trong chiến lược xây dựng phương thức và kit chẩn đoán bằng sinh học phân tử ở nước ta. Do vậy, việc nghiên cứu chẩn đoán phân tử là hết sức bức thiết, đặc biệt là nghiên cứu kit PCR đa gen/đa mồi (multiplex-PCR) đối với ký sinh trùng mà chúng tôi đang xây dựng sẽ giúp cho việc chẩn đoán hoàn toàn chính xác và góp phần to lớn trong phòng chống bệnh có hiệu quả trong phạm vi cả nước (Lê Thanh Hòa, 2009). Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới đã được phát triển và giới thiệu ứng dụng, gọi là phương pháp LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) tạo ra sản phẩm là DNA mạch vòm, nhìn thấy được bằng mắt thường để đánh giá kết quả (Notomi et al., 2000; Mori, Notomi, 2009). Trong vòng 10 năm qua kể từ khi được giới thiệu, LAMP đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu và xét nghiệm ở các cơ sở đối với tác nhân gây bệnh, do tính chính xác, đơn giản, hiệu suất, giá thành thấp và dễ thực hiện đánh giá. LAMP được phát triển thành bộ sinh phẩm (kit) thương mại phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới. Đến nay, đã có trên 350 công trình thực hiện LAMP, ứng dụng đối với hầu hết các loài (vi) sinh vật, ký sinh trùng gây bệnh ở người và động vật. Cùng tính đặc hiệu và tính nhạy như PCR, LAMP đã thực sự sử dụng như một phương pháp chẩn đoán tiên tiến với mọi đối tượng và trở nên cạnh tranh đắc lực với PCR, do tính nhanh chóng dễ làm, dễ đánh giá và không tốn kém nguyên vật liệu và bệnh phẩm (Nagamine et al., 2002; Parida, 2008; Mori, Notomi, 2009). Vậy phương pháp LAMP là gì? LAMP, tạm gọi là tổng hợp DNA-vòm (hay vắn tắt là kỹ thuật/phương pháp DNA-vòm) được phát triển năm 2000, là phương pháp tổng hợp DNA bằng 4 mồi đặc hiệu nhận biết 6 vùng khác biệt trên một gen đích từ một nguồn khuôn duy nhất, tạo nên một dạng sản phẩm DNA có cấu trúc vòm (stem-loop structure), hiển thị dưới dạng hỗn hợp vẩn đục màu trắng, nên dễ dàng phát hiện bằng mắt thường; nếu cho thêm chất huỳnh quang, sản phẩm sẽ phát quang dễ nhận biết hơn (Notomi et al., 2000; Parida et al., 2008). Dạng vẩn đục màu trắng chính là Magnesium pyrophosphate (Mg2P2O7) một sản phẩm phụ của phản ứng sinh ra trong quá trình tạo DNA mạch vòm rất dễ quan sát đánh giá kết quả (Mori et al., 2001). Phương pháp DNA-vòm không đòi hỏi điều kiện phòng thí nghiệm hiện đại, nhân lực trình độ cao, phản ứng xảy ra đặc hiệu, thực hiện nhanh chóng (Mori, Notomi, 2009), rất thích hợp cho chẩn đoán phân tử virus, vi khuẩn và ký sinh trùng gây bệnh ở các nước đang phát triển vùng nhiệt đới (Dong et al., 2008; Parida, 2008). Nếu như PCR/RT-PCR, bao gồm cả multiplex-PCR, cho sản phẩm đặc hiệu là DNA mạch thẳng thuận lợi cho các phương pháp sinh học phân tử phân tích đặc tính của gen/hệ gen sau khi tách dòng và giải trình tự (Powledge, 2004; Ishmael, Stellato, 2008); thì LAMP/RT-LAMP cho sản phẩm đặc hiệu là DNA bắt cặp các chuỗi lại với nhau tạo mạch vòm không thuận lợi cho tách dòng và xem xét thành phần gen/hệ gen, nhưng DNA-vòm có lợi thế cực kỳ to lớn là sản phẩm hiển thị ở dạng vẩn đục trắng do sản sinh muối pyrophosphate (Mg2P2O7) hoặc với chất phát quang nhìn thấy bằng mắt thường, phục vụ nhanh chóng cho chẩn đoán (Mori et al., 2001;Goto et al., 2009) (Hình 3). Trong trường hợp LAMP sử dụng làm kit chẩn đoán, người ta thường thiết kế thêm một cặp mồi đặc hiệu bám vào hai đầu biên của vùng gen đích để thực hiện phản ứng PCR/RT-PCR, thu sản phẩm DNA-thẳng, rồi tách dòng, giải trình tự để kiểm nghiệm tính đặc hiệu cho chắc chắn (Parida, 2008). Phương pháp kiểm tra giả nghiệm cũng được thực hiện với các nguồn khuôn khác nhau của (vi) sinh vật cùng giống (genus) để đảm bảo chắc chắn tính chính xác và đặc hiệu của kit chẩn đoán LAMP (Parida, 2008; Parida et al., 2008). Kể từ khi được giới thiệu từ những năm 2000, càng ngày càng có nhiều nghiên cứu đưa LAMP vào ứng dụng chẩn đoán ở các lĩnh vực khác nhau, trong đó có ký sinh trùng. Đối với ký sinh trùng, nhiều khi chúng cùng tồn tại ở một vị trí nên rất dễ lấy bệnh phẩm, tuy nhiên việc phân biệt trong chẩn đoán và xác nhận sự có mặt của loài gây bệnh là không dễ dàng khi sử dụng phương pháp hình thái học. Việc phát hiện đặc hiệu loài gây bệnh để phân biệt được nhiều loài khác càng nhanh càng tốt có ý nghĩa rất lớn trong chẩn đoán, do vậy, LAMP trở nên một công cụ hữu hiệu xác định nhanh đối tượng trong số đông cùng tồn tại (Criado-Fornelio, 2007; Adams, Hamilton, 2008). Trong 10 năm qua, bên cạnh việc thăm dò phương pháp và xây dựng bộ kit với tiêu chuẩn chẩn đoán sau khi khảo nghiệm, LAMP đã được ứng dụng trong thực tế với nhiều loại ký sinh trùng khcá nhau gây bệnh ở động vật và người. LAMP đã được xây dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt các loại ký sinh trùng đơn bào, trước hết đó là các loài Trypanosoma spp gây bệnh ở châu Phi (Kuboki et al., 2003; Adams, Hamilton, 2008; Thekisoe et al., 2009), bao gồm chẩn đoán phân biệt các loài trong phân giống Trypanozoon (Njiru et al., 2009) hoặc chính xác xác định loài Trypanosoma brucei rhodesiense (Njiru et al., 2008). LAMP cũng được thăm dò chẩn đoán ký sinh trùng đường máu ở động vật là Trypanosoma evansi qua kiểm tra trên lợn thực nghiệm (Thekisoe et al., 2005; 2007). Một số loại ký sinh trùng đường máu khác cũng được ứng dụng LAMP để chẩn đoán trong đó có lê dạng trùng Babesia orientalisgây bệnh ở trâu ở Trung Quốc (He et al., 2009) hay phát hiện loài Babesia gibsoni ở Nhật Bản (Ikadai et al., 2004); hoặc phân biệt các loài trong giống Babesia (Guan et al., 2008) hay các loài piroplasma bao gồm Babesia spp và Theileria spp gây bệnh ở bò (Criado-Fornelio, 2007; Thekisoe et al., 2007; Liu et al., 2008; Salih et al., 2008), đặc biệt là loài Theileria parva gây bệnh ở bò (Thekisoe et al., 2010). Đối với Leishmania donovani, Takagi et al. (2009), phương pháp LAMP chẩn đoán rất nhạy chỉ cần 1 fg khuôn DNA là đủ phát hiện và phân biệt với các loài Leishmania spp (L. infantum, L. major, L. mexicana, L. tropica, L. braziliensis) khác. Phương pháp LAMP cũng phát hiện ký sinh trùng đơn bào đường máu Toxoplasma gondii từ đất; và loài đơn bào gây bệnh sang người này đã được một số nhà nghiên cứu lấy làm đối tượng xây dựng thành kit chẩn đoán trên người (Sotiriadou, Karanis, 2008; Krasteva et al., 2009; Zhang et al., 2009) Đơn bào gây bệnh người và động vật truyền qua thức ăn nước uống thuộc giống Cryptosporidium và Giardia được đặc biệt quan tâm sử dụng LAMP do tính nhạy của phương pháp này (Bakheit et al., 2009), trước hết là chẩn đoán Cryptosporidium spp và Giardia duodenalis trong nước uống (Inomata et al., 2009; Plutzer, Tomor, 2009; Karanis, 2010) và trong động vật truyền lây (Plutzer, Tomor, 2009), trong phân thải và môi trường (Karanis et al., 2007). Bên cạnh đó lỵ amíp Acanthamoeba (Lek-Uthai et al., 2009) hay Entamoeba histolytica (Liang et al., 2009) cũng là đối tượng của phương pháp chân đoán mới này. Một trong những ứng dụng có hiệu quả trong sử dụng LAMP đó là phát triện phương pháp chẩn đoán phân biệt 4 loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp (Han et al., 2007; Aonuma et al., 2008) hoặc đơn lẻ từng loài Plasmodium falciparum (Poon et al., 2005; Yamamura et al., 2009) và Plasmodium vivax (Chen et al., 2010). Đối với giun tròn, chỉ mới có một công trình nghiên cứu xây dựng phương pháp LAMP chẩn đoán giun chỉ Dirofilaria immitis từ vector là muỗi (Aonuma et al., 2009); và đối với sán dẹt, mới có loài sán máng Schistosoma japonicum (Xu et al., 2010) và các loài sán dây Taenia spp (Nkouawa et al., 2009) làm đối tượng của LAMP. Giun tròn và sán dẹt gây bệnh truyền từ động vật sang người còn có rất nhiều loài nguy hiểm khác cần được xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh bằng LAMP. Tài liệu tham khảo 1.Lê Thanh Hòa (2010). Nghiên cứu ứng dụng phương pháp tổng hợp DNA sản phẩm đa mồi trong chẩn đoán phân tử xác định và phân biệt ký sinh trùng. http://www.impe-qn.org.vn 2.Lê Văn Phủng. Một số ứng dụng của PCR trong vi sinh vật y học. Trường Đại học y Hà Nội. 3.Grimpel E, Sanchez PJ. et al. Use of polymerase chain reaction and rabbit infectivity testing to detect Treponema pallidum in amniotic fluid, fetal and neonatal sera and cerebrospinal fluid. J. Clin. Microbiol. 29: 1711 - 1718, 1991. 4.Rosa PA and Schuan TG. A specific and sensitive assay for the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi using polymerase chain reaction. J. Infect. Dis. 160: 1018 - 1029, 1989. 5.Wise DJ and Weave TL. Detection of Lyme disease bacterium. Borrelia burgdorferi, by using the polymerase chain reaction and a nonradioisotopic gene probe. J. Clin. Microbiol. 29: 1523 - 1526, 1991. 6.Mahony JB. et al. Multiplex polymerase chain reaction for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genitourinary specimens. J. Clin. Microbiol. 33: 3049 - 3053, 1995. 7.Mahony JB. et al. Detection of Chlamydia trachomatis. Neisseria gonorrhoeae, Ureaplasma urealyticum, and Mycoplasma genitalium in first-void urine specimens by multiplex polymerase chain reaction. Mol. Diagn. 2 (3): 161 - 168, 1997. 8.Tachibana H, Ihara S and Kobayashi S, Et al. Differences in genomic DNA sequences between pathogenic and nonpathogenic isolates of Entamoeba histolytica identified by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 29: 2234 - 2239, 1991. 9.Yokosuka O, Tagawa M and Omata M. Polymerase chain reaction. detection of hepatitis B. Viral pathogens. 322 - 326. 1992. 10.Baginski I, Ferrie A. et al. Detection of Hepatitis B virus.. In: Innis MA, Gelfand DH et al (Eds). A guide to methods and applications. Academic Press, Inc. Harcount Brace Jovanovich Pub. 348 - 355, 1990.
|
TRANG CHỦ
