Ngoài yếu tố dịch tễ và lâm sàng, để xác định người bệnh bị nhiễm ký sinh trùng sốt rét giúp cho việc chẩn đoán bệnh một cách chính xác, trước đây thường chỉ dựa vào hình thể của ký sinh trùng soi phát hiện dưới kính hiển vi quang học. Ngày nay do sự phát triển của nền khoa học kỹ thuật, đặc biệt là ngành miễn dịch học và sinh học phân tử nên việc chẩn đoán ký sinh trùng đã trở nên dễ dàng, thuận lợi hơn. Phương pháp miễn dịch học căn cứ vào việc phát hiện kháng thể, kháng nguyên của ký sinh trùng. Kỹ thuật sinh học phân tử là một kỹ thuật giúp xác định ký sinh trùng một cách hiện đại.

Việc chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét hiện đại dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử (Molecular Biology Detection Test) được áp dụng hiện nay là kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).

Nguyên lý kỹ thuật

Mọi sinh vật sống đều có cơ sở di truyền là ADN (Acid deoxyribonucleic) gồm hai sợi xoắn vào nhau. Mỗi sợi được cấu tạo từ các nhân purin, pyrimidin, một số đường pentoza và H₂PO₄. Trình tự sắp đặt các nucleotid trên mỗi sợi là riêng biệt đặc hiệu cho từng loài. Dựa vào sự phân tích trình tự sắp xếp các nucleotid để có thể chẩn đoán được loài.

Trong kỹ thuật PCR, sử dụng các vật dò gọi là ADN probe và dựa trên cơ sở lai ghép ADN mà ở đó hai sợi bổ sung cho nhau của vòng xoắn ADN được tách rời nhau do hóa học hoặc xử lý nhiệt. Những sợi tách này sau đó được tiếp xúc với ADN probe. Vật dò với kỹ thuật tái tổ hợp ADN, có thể nhận được hàng trăm bản sao của trình tự nucleotid đặc hiệu của một chủng loại ký sinh trùng sốt rét. Xử lý lần thứ hai sẽ cho phép các mảnh cá thể của vật dò ADN lai với trình tự nucleotid tổng hợp của mẫu thử nghiệm tái tạo vài lần nữa trạng thái bình thường của vòng xoắn sợi kép ADN. Nếu vật dò được đánh dấu với một chỉ thị như chất đồng vị phóng xạ hoặc một enzym chỉ thị sắc kế màu, sự có mặt của trình tự nucleotid đặc hiệu có thể được phát hiện bằng chụp ảnh và chủng loại được chẩn đoán. Như vậy các ADN probe có thể được điều chế đặc hiệu cho loài duy nhất của Plasmodium falciparum.

Phần lớn các ADN probe có thể kiếm được là đặc hiệu cho Plasmodium falciparum và nhạy với số lượng ký sinh trùng thấp như 5 ký sinh trùng sốt rét thể vô tính/ ml máu. Vật dò ARN (Acid ribonucleic) mang lại nhiều hứa hẹn. Chức năng ARN polymerase về bản chất là sao các bản gen để dịch mã vào protein. Sản phẩm ARN polymerase là một bản sao của ADN, chúng có cùng một trình tự cơ bản duy nhất như ADN và khi tách biệt thành các sợi đơn có thể lai với nó. Tuy nhiên ADN kém ổn định và có thể có phản ứng chéo với loài có thể xuất hiện. Kỹ thuật có thể phát hiện được 10 ký sinh trùng sốt rét thể vô tính/ ml máu.

Phản ứng chuẩn (the standard reaction)

Cho đến nay đã có quá nhiều ứng dụng của PCR để chẩn đoán loài, mỗi ứng dụng có thể có các quy trình phản ứng riêng. Tuy nhiên mọi quy trình đều có nguyên tắc chung gồm các bước và các thành phần chính sau:

- Mẫu ADN chứa 50 mM KCl, 10 mM Tris.HCl (pH=8,4 ở nhiệt độ phòng thí nghiệm), 1,5 mM MgCl₂, 100 µg/ml gelatin; 0,25 µg mỗi loại mồi (primer), 200 µM mỗi loại deoxynucleotid triphosphat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) và 2,5 đơn vị Taq polymerase. Loại mẫu ADN có thể thay đổi, tuy nhiên nó thường có khoảng 10² đến 10⁵ đơn vị khuôn mẫu (khoảng 0,1 µg ADN gen người).

- Sự khuếch đại có thể được thực hiện một cách thuận tiện trong máy chu kỳ nhiệt ADN (ADN Thermal reactor-Hybaid-England) sử dụng chương trình chu kỳ-bước (cycle-step) để làm biến tính (denature) ở 90,4^oC trong 20 giây, bắt cặp (aneal) ở 55^oC trong 20 giây và kéo dài (extend) ở 72^oC trong 30 giây với tổng số 30 chu kỳ.

- Những điều kiện trên được sử dụng khuếch đại một phạm vi rộng các chuỗi đích với độ đặc hiệu cao.

Nguyên liệu và phương pháp thực hiện kỹ thuật PCR

+ Mẫu thử nghiệm là ký sinh trùng sốt rét nuôi cấy liên tục tại phòng thí nghiệm hoặc các mẫu thu thập được từ bệnh nhân sốt rét ở tại thực địa.

+ Phản ứng PCR

- Thông thường phản ứng PCR được thực hiện từ 25 đến 35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm 3 giai đoạn:

. Biến tính để mở đoạn kép ADN,

. Ủ để mồi oligonucleotid tiếp cận với đoạn ADN đích,

. Tổng hợp (tức kéo dài mồi)

- Thành phần trong phản ứng PCR:

. PCR buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,3; 1 mM KCl; 1,5 mM MgCl₂; 100 µg/ml gelatin, Tween 20 - 0,05%, NP 40 - 0,05%).

. dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 200 µM,

. Mồi (printer: sử dụng đôi mồi để phân gen DHFR (Dihydro folate reductase).

GS2 - 5’ CTTCTCCTTTTATACAATTTTGTTC 3’ - 20 pmol

GS3 - 5’ ATGATGGAACAAGTCTGGGAC 3’ - 20 pmol

(A: adenin, C: citizin, G: guanin, T: thymidin)

. Taq - ADN polymerase 2,5 đơn vị

. ADN khuôn - 10 pg.

- Cho nước vừa đủ 50 µl. Sau cùng cho 1 giọt dầu (mineral oil-SIGMA) để tránh bốc hơi trong quá trình phản ứng. Mỗi chu kỳ thực hiện theo điều kiện:

. Biến tính 94^oC – 1 phút

. Mồi tiếp xúc 55^oC – 1 phút

. Tổng hợp 72^oC – 2 phút

+ Phản ứng có 35 chu kỳ và được thực hiện trên máy điều nhiệt. Trong giai đoạn tổng hợp của chu kỳ cuối cùng để 8 phút, sau đó hạ nhiệt độ xuống 10^oC.

+ Sản phẩm PCR được trộn với bromphenol blue và chạy điện di trên thạch (agarose gel) 1%. Điện áp 100V, thời gian chạy 30 phút. Sau đó nhuộm với ethidium bromide. Sản phẩm được phân tích kết quả trên băng điện di với đèn tử ngoại (λ = 310 nm). Dùng máy ảnh có màng lọc tia tử ngoại để chụp, sau đó đọc kết quả.

Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật

PCR là kỹ thuật hiện đại dựa trên cơ sở phân tích mã di truyền nên có độ chính xác cao giúp chẩn đoán tới loài. Muốn thực hiện cần phải có trang thiết bị hiện đại, điều kiện phòng thí nghiệm đúng tiêu chuẩn và có đội ngũ cán bộ trình độ cao để sử dụng, phân tích kết quả. Bằng cách khuếch đại đoạn nucleotid đặc trưng của từng loài ký sinh trùng sốt rét, kỹ thuật PCR có thể phát hiện ký sinh trùng trong máu với độ nhạy cao mà không có kỹ thuật nào so sánh được vì chỉ cần có ký sinh trùng sốt rét trong mẫu thử là có sự hiện diện của nucleic acid đích và được PCR khuyếch đại.

Do kỹ thuật PCR quá nhạy cảm nên khi áp dụng trong chẩn đoán một vấn đề rất quan trọng phải chú ý đến hiện tượng dương tinh giả, chủ yếu do mẫu thử đã bị nhiễm các sản phẩm PCR trước đó. Chỉ cần mẫu thử bị nhiễm một hoặc vài mảnh sản phẩm PCR thì các mảnh này sẽ được khuếch đại và cho kết quả dương tính nhưng là dương tính giả.

Một số kết quả ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử

Nhà khoa học Lê Đức Đào và cộng sự đã áp dụng kỹ thuật phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase lồng (Nested PCR) để khảo sát thành phần cơ cấu của 4 chủng loại ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người ở các tỉnh Khánh Hòa, Lâm Đồng, Bình Phước, Đăk Lăk thuộc vùng sốt rét lưu hành nặng. Kết quả cho thấy có sự tồn tại của cả 4 chủng loại ký sinh trùng sốt rét trên người và tỷ lệ nhiễm phối hợp 2, 3 hoặc 4 chủng loại ký sinh trùng sốt rét trên một bệnh nhân khá cao, chiếm từ 24 đến 81%. Nếu thực hiện bằng kỹ thuật lấy lam máu, nhuộm giemsa và soi dưới kính hiển vi thường chỉ phát hiện được 3 chủng loại ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax và Plasmodium malariae ở Việt Nam và tỷ lệ nhiễm phối hợp 2 chủng loại Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax thường chỉ chiếm từ 1,04 đến 1,6%.

Nhà nghiên cứu Lê Đức Đào, Nguyễn Xuân Thành và cộng sự cũng đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện chủng loại ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum mang gen kháng thuốc chloroquin là PFTCR (Plasmodium falciparum transporter chloroquine resistance) và mang gen kháng thuốc pyrimethamine là DHFR (Dihydro folate reductase).

Ngoài ra cũng bằng kỹ thuật PCR, các nhà khoa học đã phân biệt được hiện tượng tái phát và tái nhiễm theo kiểu gen của Plasmodium falciparum. Kết quả này có ý nghĩa rất lớn và quan trọng trong nghiên cứu đánh giá ký sinh trùng kháng thuốc tại thực địa.

Một nhóm nghiên cứu bao gồm các nhà khoa học của Mỹ và Anh đã lập được bản đồ gen của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum. Bản đồ gen này đã cung cấp một công cụ và một cách nhìn mới, đưa đến các đích mới đầy triển vọng cho các loại thuốc, vaccine và mang lại hy vọng tìm ra phương pháp điều trị mới. Với 14 nhiễm sắc thể và có 5.279 gen, bộ gen của ký sinh trùng sốt rét là một trong những chuỗi nhỏ nhất nhưng ADN của nó không bền vững và dễ bị vỡ ra khi thực hiện các phản ứng.

Hiện nay kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định ký sinh trùng sốt rét chỉ mới được trang bị cho các viện nghiên cứu và những trung tâm, bệnh viện lớn vì nó đòi hỏi phải có phòng thí nghiệm với trang thiết bị, máy móc, hóa chất hiện đại và đắc tiền; đồng thời cũng phải có đội ngũ cán bộ khoa học với trình độ cao để sử dụng thiết bị kỹ thuật, phân tích và đánh giá kết quả một cách chính xác. 

Các nội dung khác »

---

• Kỹ thuật mới có thể phát hiện nhanh biến đổi gen bên trong ký sinh trùng sốt rét tại thực địa (06/03/2024)
• Giải trình tự thế hệ mới góp phần làm sáng tỏ một số bệnh truyền nhiễm (11/08/2023)
• Cập nhật về nghiên cứu một số vaccine phòng bệnh sốt rét (23/06/2023)
• Tính sinh miễn dịch của hai ứng viên vaccine sốt rét hàng đầu được cung cấp dưới dạng vaccine mrna-lnp (03/04/2023)
• Thêm một kỹ thuật sinh học phân tử mới giúp tăng tốc loại trừ sốt rét và nghiên cứu một số lĩnh vực y sinh khác (20/06/2022)
• Cần thận trọng vì kháng thể đơn dòng evusheld không phải “siêu vaccine” chống lại COVID-19 (Evusheld (tixagevimab + cilgavimab) for Pre-exposure Prophylaxis (PrEP) of COVID-19) (21/03/2022)
• Cán bộ nhân viên Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn thực hiện xét nghiệm SARS-CoV-2 cho các tỉnh miền Trung-Tây Nguyên chung tay phòng, chống dịch bệnh COVID-19 (21/07/2021)
• Mất gen Pf-HRP2/3 và ký sinh trùng kháng thuốc là hai trong ba mối đe dọa sinh học trong cuộc chiến chống lại bệnh sốt rét trên toàn cầu (17/06/2020)
• Ứng dụng phương pháp phân tử loop-mediated isothermal amplification (LAMP) trong phát hiện chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn Fasciola spp. (04/06/2019)
• Một số phương pháp kỹ thuật áp dụng trong phát hiện chẩn đoán sốt rét (20/05/2019)
• Nghiên cứu ứng dụng quan kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán và phát hiện các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm (24/10/2018)
• Ký sinh trùng sốt rét ở châu Mỹ đa dạng về mặt di truyền học nhiều hơn so với suy nghĩ trước đây (14/05/2018)
• Cứ hai phút có một đứa trẻ chết vì sốt rét và hiện tại muỗi đang trở nên đề kháng với thuốc diệt côn trùng (03/01/2018)
• Một bước tiến gần hơn đến việc sản xuất ra một vaccine DNA chống lại virus sốt xuất huyết Dengue (25/07/2017)
• Loài muỗi Aedes aegypti gây nhiễm Chikungunya lần đầu tiên được phát hiện ở Brazil (23/06/2017)