 |
| (ảnh minh họa) |
Đánh giá chất lượng thuốc sốt rét tại labo bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Thin layer Chromatography_TLC)
Thực trạng và diễn tiến của nạn sản xuất và kinh doanh ngày càng phức tạp và quy mô lớn. Lơi nhuận đã làm mờ mắt những kẻ trục lợi làm thuốc giả ? Quả thực, hoạt động sản xuất và buôn bán thuốc giả đã mang lại lợi nhuận khổng lồ và làm mờ mắt nhóm tội phạm “khoa học” có tổ chức và núp bóng dưới các công ty dược đang tung ra thị trường hàng triệu viên thuốc giả mỗi ngày. Chúng có trong tay những trang thiết bị tối tân và công nghệ cao nhất cho hoạt động, như thiết bị chế bản điện tử để làm nhãn mác giả mà không thể phân biệt các nhãn mác thật trên thị trường. Với chi phí chỉ bằng 20% so với việc sản xuất thuốc thật, những kẻ làm giả đút túi một khoảng tiền lớn, thậm chí khi chúng bán ra thị trường giá chỉ ½ giá thuốc thật. Thật khó đánh giá hết hậu quả của thuốc giả, nó ảnh hưởng đến sức khỏe, tính mạng người bệnh, tới hoạt động kinh doanh của các công ty dược phẩm làm ăn chân chính, gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế. Trong số những nguyên nhân khiến hoạt động sản xuất và buôn bán thuốc giả ở khu vực châu Á phát triển mạnh mẽ, không thể không kể đến tình trạng thiếu những chế tài nghiêm khắc và thích đáng cho những kẻ phạm tội. - Năm 1998, Hiệp hội sức khỏe thế giới đã đưa ra đề nghị có tính kiên quyết với các chính phủ và các nhà sản xuất dược phẩm là thành viên của tổ chức y tế thế giới (WHO) “Cần hợp tác trong việc phát hiện và ngăn ngừa sự gia tăng về xuất nhập khẩu hay buôn lậu các thuốc giả và thuốc kém chất lượng”. - Khi các sản phẩm này gia tăng mỗi năm nhất là các nước đang phát triển. Việt Nam là một nước đang phát triển vì vậy việc đảm bảo chất lượng thuốc hay các chế phẩm dược luôn là một nội dung quan trọng, cần thiết trong hệ thống chăm sóc sức khỏe. - Việc áp dụng các phép thử cơ bản để kiểm tra chất lượng thuốc nhằm sàng lọc nhanh các thuốc giả, thuốc kém chất lượng cần được áp dụng ở tất cả các tuyến. Thuốc sốt rét cũng là 1 nhóm thuốc nằm trong chương trình y tế quốc gia, cần áp dụng cơ bản để sàng lọc nhanh các thuốc giả và thuốc kém chất lượng. Hội đồng Duợc điển Hoa kỳ và Tổ chức y tế thế giới đã nhiều lần tổ chức các hội nghị, các khóa đào tạo về các phép thử cơ bản cho các thành viên đến từ các nước nằm trong tiểu vùng Sông Mekong. A. Phép thử độ tan rã - Là một phép thử ban đầu, cần thiết để đánh giá khả năng hấp thu thuốc vào cơ thể vì viên thuốc có rã ra mới thực hiện được quá trình hòa tan. - Phép thử này xác định việc viên nén hay viên nang có rã hay không trong khoảng thời gian qui định khi đặt trong môi trường lỏng dưới những điều kiện thực nghiệm qui định. - Thực tế khi áp dụng bộ minilab kit: + Dùng chai thủy tinh có dung tích 100-150ml, có nắp đậy, lắc tay. + Tiến hành: cho vào mỗi chai thỷ tinh 100ml nước ở 370C ± 20C, thả một viên thuốc vào lọ và đậy nắp. Đặt đồng hồ để theo dõi, lắc nhẹ bình theo một chiều, mỗi phút 2 lần, mỗi lần 10 giây. Chú ý quan sát khi nào thuốc tan hết, ghi lại thời gian. Lặp lại phép thử với 5 viên khác. + Đánh giá: mẫu được coi là đạt khi cả sáu viên tan rã trong thời gian qui định (30 phút cho viên nén). Nếu có một viên không đạt thì thử tiếp 6 viên khác, không được có quá một viên trong tổng số 12 viên thử không tan rã thì mẫu đạt. B. Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography_TLC) là một kỹ thuật liên quan đến biểu đồ sắc ký (chromatography technique) sử dụng một hợ chất phân tách. TCL được thực hiện trong một sheet thủy tinh, bằng plastic hoặc bằng lá nhôm, các chất liệu bản mỏng này được phủ bởi một lớp có bản chất hấp phụ (“adsorbent”), thường là silicagel, aluminium oxide, hoặc cellulose (giấy bản thấm). Lớp được hấp phụ được xem như là một pha tính (stationary phase). Sau khi mẫu đã được đưa lên trên plate, một hỗn hợp dung môi hòa tan hoặc dung môi hòa tan (được xem là pha động) bắt đầu thực hiện thong qua quá trình mao dẫn. Vì các chất phân tích khác nhau trên bản TLC platetại các tỷ lệ khác nhau, nên việc phân tích và định kết quả rõ ràng. Kỹ thuật TCL có thể dùng để giám sát tiến trình phản ứng, xác định các thành phần hoặc hợp chất có mặt trong hỗn hợp và xác định độ tính khiết của một chất. 1. Nguyên tắc - Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) là kỹ thuật phân tích sắc ký hai pha lỏng rắn, trong đó pha tĩnh là lớp chất hấp phụ (pha rắn) được trải thành những lớp mỏng trên những tấm kính hay kim loại, pha động là các dung môi hay hệ dung môi thích hợp (pha lỏng). - Các chất cần phân tích ở dưới dạng dung dịch được đưa lên bảng mỏng và đặt bảng mỏng trong bình triển khai sắc ký với hệ dung môi thích hợp, các chất cần phân tích sẽ chuyển động theo chiều chuyển động của dung môi. Do khả năng hấp phụ khác nhau giữa các chất, do ái lực giữa hai pha của các chất khác nhau mà sự di chuyển của chúng khác nhau. Từ đó có thể xác định được giá trị Rf của các chất cần phân tích và chất chuẩn cần tiến hành song song trên cùng một bản mỏng, trong cùng một điều kiện. Giá trị Rf được tính theo công thức: Phương pháp này dùng hai nồng độ chất chuẩn: 100% và 80%.  | Sơ đồ một bản sắc ký và vị trí các vết chất chuẩn và chất thử |
C100%: nồng độ chuẩn 100%, C80%: nồng độ chuẩn 80%, T: chất cần phân tích.
Chú ý:Giá trị Rf phụ thuộc vào 3 yếu tố sau: 1. Bản chất của chất tinh (không lẫn tạp) chạy sắc ký: trong cùng hệ dung môi, trên cùngloại bản mỏng, các chất khác nhau có Rf khác nhau (theo lý thuyết vì trên thực tế có nhiều chất trên cùng hệ dung môi và loại bản mỏng có Rf rất gần nhau, không thể phân biệt được) 2. Hệ dung môi: pha động 3. Pha tĩnh: Mà ở đây là silica gel trên bản mỏng của bạn đó (chú ý là bản mỏng có nhiềuloại khác nhau nhé: Silica gel và alumina, nhưng loại silica gel là dùng phổ biến).à Tựu trung Rf phụ thuộc vào sự tương tác của 3 yếu tố kể trên. - Phương pháp kiểm tra và phân tích từng loại thuốc được thực hiện theo sổ tay hướng dẫn kiểm tra chất lượng các thuốc thiết yếu của German Pharma Health Fund (GPHF). 2. Thuốc, dụng cụ, hóa chất 2.1. Thuốc - Các thuốc sốt rét: atersunat, chloroquin, quinin, primaquin….được thu thập tại các điểm thực địa khác nhau. Dạng bào chế: viên nén, viên bao, viên nhộng và thuốc tiêm. - Các chất chuẩn do German Pharma Health Fund (GPHF) cung cấp. 2.2. Dụng cụ và hóa chất - Chày sứ, lá kim loại bằng nhôm, bình thủy tinh dung tích từ 25–100ml, phễu lọc, pipet thẳng 1-25ml, lọ thủy tinh nhỏ dung tích 10 và 25 ml, ống mao quản thủy tinh 2μl. - Tấm sắc ký được phủ silicagen 60F254, cỡ 5x10cm, bàn là, bình triển khai sắc ký, đèn tử ngoại bước sóng 254 và 366 nm, bình phát hiện, đĩa petri và bình iod. - Nhãn dính, bút dạ, bút chì, giấy lọc, kéo, panh, kẹp. - Dung môi: nước cất, methanol, acid sufuric đặc 96%, acid acetic đặc, ethyl acetat, aceton, acetonitril, dung dịch amoniac đậm đặc… 3. Các bước tiến hành kỹ thuật 3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn 3.1.1. Dung dịch chuẩn artesunate - Dung dịch chuẩn artesunate 100%: Lấy một viên nén artesunate 50mg chuẩn bọc trong lá nhôm và dùng chày sứ nghiền thành bột mịn. Đổ bột đã nghiền mịn vào trong bình thủy tinh dung tích 25ml và dùng pipet 10ml tráng sạch giấy nhôm với 10ml methanol. Đóng nắp bình và lắc khoảng 3 phút để cho hoạt chất được hòa tan trong dung môi. Để yên lọ trong 5 phút để cho những phần không tan lắng xuống dưới. Dung dịch phía trên chứa 5mg artesunate trong 1ml dung dịch. Nếu là dạng thuốc tiêm thì không cần nghiền, đổ thẳng bột vào trong lọ và thao tác tương tự. Dung dịch này pha xong được dùng ngay. - Dung dịch chuẩn artesunate 80%: Dùng pipet lấy 4 ml dung dịch chuẩn artesunate 100% cho vào lọ dung tích 10ml, thêm 1ml methanol. Đóng nắp lọ và lắc. dung dịch này có chứa 4mg artesunate trong 1ml dung dịch. Dung dịch chuẩn artesunate 80% có nồng độ thấp là sản phẩm kém chất lượng, chứa 80% hoạt chất ghi trên nhãn. Đây là sản phẩm dưới mức giới hạn cho phép. 3.1.2. Dung dịch chuẩn chloroquine phosphat - Gói 1 viên nén chloroquine phosphat 250mg chuẩn vào trong giấy nhôm, dùng chày sứ nghiền thành bột mịn. đổ bột đó vào bình thủy tinh 100ml, tráng sạch bột trên giấy nhôm bằng pipet với 50ml nước cất. đậy nắp và lắc khoảng 3phút cho hoạt chất được hòa tan hết trong nước cất. để yên 5 phút cho phần bột không tan lắng xuống đáy, phần dung dịch phía trên là dung dịch chuẩn có chứa 5mg hoạt chất trong 1ml dung dịch. Dung dịch chuẩn chỉ pha ngay trước khi dùng. - Dung dịch chuẩn chloroquine phosphat 100%: Dùng pipet hút 2ml dung dịch chuẩn ở trên cho vào bình dung tích 10ml, thêm 2ml nước cất. đậy nắp và lắc. dung dịch này chứa 2,5mg chloroquine phosphat trong 1ml. Dán nhãn dung dịch chuẩn chloroquine phosphat 100% - Dung dịch chuẩn chloroquine phosphat 80%: Dùng pipet hút 2ml dung dịch chuẩn ở trên cho vào bình dung tích 10ml, thêm 3ml nước cất. đậy nắp và lắc. dung dịch này chứa 2mg chloroquine phosphat trong 1ml. Dán nhãn dung dịch chuẩn chloroquine phosphat 80% 3.1.3. Dung dịch chuẩn primaquin Gói 1 viên nén primaquin base chuẩn15mg vào trong giấy nhôm và dùng chày sứ nghiền thành bột mịn. đổ bột này vào bình thủy tinh 25ml và pipet thẳng tráng sạch bột trên giấy nhôm với 15ml nước cất. đậy nắp vá lắc khoảng 3phút cho họat chất được hòa tan trong dung môi. Để yên bình trong 5 phút cho phần bột không tan lắng xuống đáy. Dung dịch không tan phía trên là dung dịch chuẩn gốc có chứa 1mg primaquin trong 1 ml. Dung dịch này chỉ pha trước khi dùng. - Dung dịch chuẩn primaquin 100%: Chuyển phần dung dịch gốc ở trên vào 1 ống dung tích 10ml, đây là dung dịch chuẩn 100%,có chứa 1mg primaquin trong 1 ml. Dung dịch này đại diện cho sản phẩm thuốc có chất lượng tốt, chứa 100% primaquin. - Dung dịch chuẩn primaquin 80%: Lấy 4 ml dung dịch chuẩn gốc ở trên cho vào lọ nhỏ dung tích 10ml, thêm 1ml nước cất. Đậy nắp bình và lắc. Dung dịch này có chứa 0,8mg primaquin trong 1ml và được dán nhãn dung dịch chuẩn primaquin 80%. 3.1.4. Dung dịch chuẩn sufadoxin – pyrimethamin Gói 1 viên nén chuẩnsufadoxin – pyrimethamin 500-25mg vào trong giấy nhôm, dùng chày sứ nghiền thành bột mịn. Đổ bột đó vào trong bình thủy tinh 25ml, tráng sạch bột trên giấy nhôm bằng pipet với 20 ml methanol. Đậy nắp bình và lắc trong khoảng 3 phút cho hoạt chất được hòa tan hết trong dung môi. Để yên khoảng 5 phút cho phần bột không tan lắng xuống đáy, phía trên là dung dịch chuẩn sufadoxin – pyrimethamin chứa 25-1,25 mg trong 1 ml dung dịch. Dung dịch này chỉ pha trước khi dùng. - Dung dịch chuẩn sufadoxin – pyrimethamin 100%: Dùng pipet hút 1ml dung dịch chuẩn ở trên cho vào bình dung tích 10 ml, thêm 3 ml methanol. Đậy nắp và lắc. Dung dịch này chứa 6,25-0,3125 mg hoạt chất trong 1 ml. Dán nhãn dung dịch chuẩn sufadoxin – pyrimethamin 100%. - Dung dịch chuẩn sufadoxin – pyrimethamin 80%: Dùng pipet hút 1 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình dung tích 1 ml, thêm 4 ml methanol. Đậy nắp và lắc. Dung dịch này chứa 5-0,25 mg hoạt chất trong 1 ml. Dán nhãn dung dịch chuẩn sufadoxin – pyrimethamin 80%. 3.2. Chuẩn bị mẫu thử Tiến hành tương tự mẫu chuẩn ở dạng dung dịch nồng độ 100%. 3.3. Chấm sắc ký Lấy bút chì kẻ 1 đường thẳng cách mép dưới của bản sắc ký 1,5cm. Dùng ống mao quản (2μl) hút dung dịch chuẩn và dung dịch thử rồi chấm trên đường thẳng đã được kẻ trước ở trên với khoảng cách đều nhau. Có thể chấm 5 vết trong 1 bản sắc ký. Dùng đèn UV 254nm để kiểm tra sự tương đồng của các vết. tát cả các vết chấm phải có hình tròn đều nhau. Bộ phận chấm sắc ký bằng máy 3.4. Chạy sắc ký Dùng pipet hút chính xác từng dung môi cho vào bình triển khai sắc ký. Mỗi thuốc khác nhau sử dụng các hệ dung môi khác nhau: - Đối với atersunat: 18ml ethylacetat, 4ml aceton và 0,4ml dung dịch acid acetic băng. - Đối với chloroquin phosphat: 20ml methanol, 5ml ethylacetat và 0,5ml amoniac đậm đặc. - Đối với primaquin: 5ml ethylacetat, 20ml methanol và 0,5ml amoniac đậm đặc. - Đối với sufadoxin – pyrimethamin: 15 ml ethyacetat và 5 ml methanol Sau khi cho dung môi vào bình sắc ký, đập nắp và lắc đều. Cắt mẫu giấy lọc để dựa vào thành bình để dung môi bảo hòa (khoảng 15 phút). Cẩn thận đặt bảng sắc ký đã được chấm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào trong bình sắc ký. Đóng kín nút lọ sắc ký, chờ đến khi dung môi chạy được khoảng 3/4 độ dài của bản sắc ký (khoảng 15-20 phút) thì chuyển bản sắc ký ra ngoài, đánh dấu mức dung môi và đợi khô, có thể bay hơi dung môi bằng cách sấy khô bằng dụng cụ làm nóng nếu cần thiết. 3.5. Phát hiện 3.5.1. Với artersunat Sau khi lấy bản sắc ký từ bình triển khai ra, để khô và nhúng vào dung dịch có chứa: 1ml acid sunfuric đặc 96%và 19ml methanol vàđể trong tủ sấy 1200C. Có thể thay tủ sấy bằng bàn là nóng để phát hiện vết sắc ký. Ngoài ra, có thể dùng bình iod để phát hiện các vết sắc ký. 3.5.2. Với chloroquin phosphat và sufadoxin – pyrimethamin Sau khi lấy bản mỏng trong bình triển khai sắc ký ra, làm khô hết dung môi, quan sát vết sắc ký bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm dùng đèn phát huỳnh quang, hoặc có thể đặt bảng sắc ký vào trong bình iod. 3.5.3. Với primaquin Khi bản mỏng đã được làm khô, quan sát sắc ký bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm dùng đèn phát huỳnh quang. 4. Đọc kết quả - Nếu vết của chất cần phân tích và chất chuẩn có hình dạng, kích thước, màu sắc, cường độ màu và giá trị Rf giống nhau, ta kết luận chất thử và chất chuẩn giống nhau. Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc đồ không có vết lạ. Nếu trên sắc đồ không phát hiện thấy vết của chất cần phân tích thì có thể chất cần phân tích không chứa hoạt chất như chất chuẩn. - Nếu vết của chất cần phân tích có màu sắc nhạt hơn, hình dạng nhỏ hơn nhiều so với vết C80% hoặc màu sắc đậm hơn, hình dạng vết sắc ký lớn hơn nhiều so với vết C100% (sau 2 lần kiểm tra với cùng 1 phương pháp) thì cần đánh giá hoạt chất của chế phẩm. 5. Ưu, nhược điểm của phương pháp - Ưu điểm: kỹ thuật này có thể thực hiện tại thực địa để sàng lọc các thuốc giả và thuốc kém chất lượng; - Nhược điểm: không xác định được chính xác hàm lượng hoạt chất Tài liệu tham khảo 1.Tài liệu Hướng dẫn đánh giá chất lượng thuốc sốt rét. Viện Sốt rét KST-CT TƯ (2006) 2.Tài liệu Hướng dẫn đánh giá chất lượng thuốc chống bệnh nhiễm trùng. Viện Sốt rét KST-CT TƯ (2009) 3.Tài liệu USAIDs, WHO, GPHF,… 4.Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody. Experimental organic chemistry: Principles and Practice (Illustrated edition ed.). pp. 159–173. 5.Reich, E.; Schibli A. High-performance thin-layer chromatography for the analysis of medicinal plants (illustrated edition). Thieme: New York, 2007. 6.Tables showing the thickness value of commercial regular and preparative Thin Layer Chromatography plates 7.Thin Layer Chromatography: How To http://www.reachdevices.com/TLC.html 8.Fair, J. D.; Kormos, C. M. J. Chromatogr. A 2008, 1211(1-2), 49-54. (doi:10.1016/j.chroma.2008.09.085) 9.Thin Layer Chromatography stains http://www.reachdevices.com/TLC_stains.html 10.TLC plates as a convenient platform for solvent-free reactions Jonathan M. Stoddard, Lien Nguyen, Hector Mata-Chavez and Kelly Nguyen Chem. Commun., 2007, 1240 - 1241.
|
TRANG CHỦ
