 |
| Ký sinh trùng sốt rét Plasmodium vivax trên kính hiển vi. |
Kỹ thuật PCR giúp xác định chính xác ký sinh trùng sốt rét
Theo kỹ thuật cổ điển truyền thống, muốn xác định các chủng loại ký sinh trùng sốt rét giúp cho việc chẩn đoán bệnh, kỹ thuật viên thường dùng phương pháp lấy lam máu xét nghiệm, nhuộm bằng giemsa và soi phát hiện dưới kính hiển vi quang học. Với sự tiến bộ của khoa học ngày nay, kỹ thuật PCR đã được một số cơ sở ứng dụng để giúp cho việc xác định chính xác chủng loại ký sinh trùng. Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử (molecular biology detection test) đã giúp cho ngành y học nói riêng và các ngành khoa học khác nói chung xác định chính xác một số vấn đề có liên quan. Kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng để xác định ký sinh trùng sốt rét là kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction). Nguyên lý của kỹ thuật PCR Chúng ta đã biết rằng mọi sinh vật sống đều có cơ sở di truyền là ADN (acid deoxyribonucleic) gồm 2 loại sợi xoắn vào nhau. Mỗi loại sợi được cấu tạo từ các nhân purin, pyrimidin, một số đường pentoza và H3PO4. Trình tự sắp đặt các nucleotid trên mỗi loại sợi là riêng biệt đặc hiệu cho từng loài. Dựa vào sự phân tích trình tự sắp xếp các nucleotid mà các nhà khoa học có thể xác định được loài. Trong kỹ thuật PCR, những nhà khoa học đã sử dụng các vật dò (ADN probe) và dựa trên cơ sở lai ghép ADN mà ở đó 2 loại sợi bổ sung cho nhau của vòng xoắn ADN được tách rời nhau do hóa học hoặc xử lý nhiệt. Những sợi tách này sau đó được tiếp xúc với vật dò ADN probe. Vật dò với kỹ thuật tái tổ hợp ADN, các nhà khoa học đã nhận được hàng trăm bản sao của trình tự nucleotid đặc hiệu của một chủng loại ký sinh trùng sốt rét. Xử lý lần thứ hai sẽ cho phép các mảnh cá thể của vật dò ADN lai với trình tự nucleotid tổng hợp của mẫu thử nghiệm tái tạo vài lần nữa trạng thái bình thường của vòng xoắn sợi kép ADN. Nếu vật dò được đánh dấu với một chỉ thị như chất đồng vị phóng xạ hoặc một enzym chỉ thị sắc kế màu, sự có mặt của trình tự nucleotid đặc hiệu có thể được phát hiện bằng chụp ảnh và chủng loại được xác định. Như vậy các vật dò ADN probe có thể được điều chế đặc hiệu cho loài duy nhất của Plasmodium falciparum cũng như các loài Plasmodium khác. Phần lớn các vật dò ADN probe có thể kiếm được là đặc hiệu cho Plasmodium falciparum cũng như các loài Plasmodium khác và có độ nhạy với số lượng ký sinh trùng thấp khoảng 5 ký sinh trùng sốt rét thể vô tính/ml máu. Vật dò ARN (acid ribonucleic) cũng mang lại nhiều hứa hẹn. Chức năng ARN polymerase về bản chất là sao chép các bản gen để dịch mã vào protein. Sản phẩm ARN polymerase là một bản sao của ADN, chúng có cùng một trình tự căn bản duy nhất như ADN và khi tách biệt thành các sợi đơn, có thể lai với nó. Tuy nhiên ADN kém ổn định và phản ứng chéo loàicó thể xuất hiện. Kỹ thuật này có thể phát hiện được 10 ký sinh trùng sốt rét thể vô tính/ml máu. Cho đến nay đã có quá nhiều ứng dụng của PCR để xác định loài, mỗi ứng dụng có thể có các quy trình phản ứng riêng. Tuy nhiên, mọi quy trình đều có nguyên tắc chung gồm các bước và các thành phần của một phản ứng chuẩn (standard reaction). Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật PCR PCR là một kỹ thuật hiện đại dựa trên cơ sở phân tích mã di truyền nên có độ chính xác cao, giúp cho việc chẩn đoán xác định đến loài. Muốn thực hiện được kỹ thuật này, cần phải có trang thiết bị hiện đại, điều kiện phòng thí nghiệm đúng tiêu chuẩn và có đội ngũ cán bộ có trình độ cao để sử dụng được kỹ thuật và phân tích được kết quả. Với cách khuếch đại đoạn nucleotid đặc trưng của từng loại ký sinh trùng sốt rét, kỹ thuật PCR có thể phát hiện được ký sinh trùng sốt rét trong máu với độ nhạy cao mà không có kỹ thuật nào so sánh được vì chỉ cần có ký sinh trùng sốt rét trong mẫu thử là có sự hiện diện của acid nucleic đích và được kỹ thuật PCR khuếch đại. Do kỹ thuật thử nghiệm PCR quá nhạy cảm nên khi áp dụng trong việc chẩn đoán xác định một vấn đề quan trọng, phải chú ý đến hiện tượng dương tính giả, chủ yếu do mẫu thử bị nhiễm các sản phẩm của kỹ thuật PCR trước đó. Chỉ cần mẫu thử bị nhiễm một hoặc vài mảnh sản phẩm của kỹ thuật PCR thì các mảnh này sẽ được khuếch đại và cho kết quả dương tính nhưng là dương tính giả. Một số kết quả ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định ký sinh trùng sốt rét Trước đây tại Việt Nam vào năm 2000, các nhà khoa học đã áp dụng kỹ thuật phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase lồng (Nested PCR) để khảo sát thành phần và cơ cấu của 4 chủng loại ký sinh trùng sốt rét ký sinh ở người tại 4 tỉnh thuộc vùng sốt rét lưu hành thuộc tỉnh Khánh Hòa, Lâm Đồng, Bình Phước và Đăk Lăk. Kết quả nghi nhận đã có sự tồn tại của cả 4 chủng loại ký sinh trùng sốt rét trên người gồm Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale và tỷ lệ nhiễm phối hợp 2, 3 hoặc 4 chủng loại ký sinh trùng sốt rét trên một bệnh nhân là khá cao, chiếm tỷ lệ từ 24% đến 81%. Trong khi đó, bằng kỹ thuật xét nghiệm lam máu nhuộm giemsa và soi dưới kính hiển vi quang học thường chỉ phát hiện được 3 chủng loại ký sinh trùng sốt rét gồm Plasmodium falciparum, Plasmodiun vivax và Plasmodium malariae hiện diện tại Việt Nam; tỷ lệ nhiễm phối hợp 2 chủng loại ký sinh trùng Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax cũng thường chỉ ghi nhận được từ 1,04% đến 1,6% bằng kỹ thuật xét nghiệm cổ điển truyền thống này. Các nhà khoa học cũng đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện được chủng loại ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum mang gen kháng thuốc chloroquine là Pftcr (Plamsodium falciparum transporter chloroquine resistance) và mang gen kháng thuốc pyrimethamine là Dhfr (Dihydro folate reductase). Ngoài ra cũng bằng kỹ thuật PCR, các nhà khoa học đã phân biệt được hiện tượng sốt rét tái phát và sốt rét tái nhiễm theo kiểu gen của Plasmodium falciparum. Kết quả này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu đánh giá ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc tại thực địa. Với kỹ thuật đã ứng dụng, một nhóm gồm 150 nhà khoa học của Mỹ và Anh đã lập được bản đồ gen của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum. Bản đồ gen này cung cấp một công cụ và một cách nhìn mới, đưa đến các đích mới đầy triển vọng cho các loại thuốc điều trị, vaccine phòng bệnh và mang lại hy vọng tìm ra phương pháp điều trị mới. Với 14 nhiễm sắc thể và 5.279 gen, bộ gen của ký sinh trùng sốt rét là một trong những chuỗi nhỏ nhất nhưng ADN của nó không bền vững và dễ bị vỡ ra khi thực hiện các phản ứng.
|
TRANG CHỦ
