Tính đặc hiệu của miễn dịch immunoblot trong chẩn đoán bệnh viêm màng não có tăng bạch cầu ái toan (EOM)
Viêm màng não có tăng bạch cầu ái toan (EOM) là một tình trạng lâm sàng được chẩn đoán khi có hơn 10% số lượng bạch cầu ái toan hiện diện trong dịch não tuỷ (Kuberski2006,Wilson&Weller2006, Sawanyawisuth&Sawanyawisuth,2008). Đó là một bệnh mới nổi và được tìm thấy phổ biến nhất ở các quốc gia ở khu vực Đông Nam Á, đặc biệt ở Đông bắc Thái Lan. Gần đây, bệnh cũng được báo cáo nhiều nơi trên thế giới với số ca rải rác (Wang và cộng sự., 2008). AngiostrongyluscantonensisandGnathostoma spinigerumlà hai loại ký sinh trùng gây bệnh EOM chính quan trọng và có thể dẫn đến tử vong nếu không điều trị kịp thời (Punyagupta và cs.. 1990, Solomon và cs., 2006). Mặc dầu cả Angiostrongyliasis và Gnathostomiasis có thể chẩn đoán phân biệt bằng lâm sàng nhưng xác định tác nhân gây bệnh có thể không rõ ràng trong chẩn đoán ở một số bệnh nhân (Ramirez-Avila và cs., 2009) và điều này có thể dẫn đến chẩn đoán lâm sàng và điều trị không chính xác trên từng ca bệnh. Một số test huyết thanh được chứng tỏ là các test chẩn đoán với bệnh Angiostrongyliasis và Gnathostomiasis. Hầu hết các nghiên cứu về bệnh EOM ở người có sức khoẻ bình thường hay các đối tượng nhiễm các loại giun khác nhau như các đối tượng chứng (Nopparatana và cs., 1991, Tapchaisri và cs., 1991, Eam- sobhana và cs., 2001,Maleewong và cs., 2001,Anantaphruti và cs., 2005, Laummaunwai và cs., 2007, Intapan và cs., 2010). Có một số nghiên cứu nhằm cải tiến, hạn chế loại bỏ phản ứng chéo giữa 2 loại ký sinh trùng gây bệnh EOM. Nhóm tác giả gồm Kanlayanee Sawanyawisuth, Kittisak Sawanyawisuth, Pewpan M Intapan, Piyarat Khotsri, Jaturat Kanpittaya, Verajit Chotmongkol và Wanchai Maleewong đang công tác tại khoa hóa sinh, khoa nội và khoa ký sinh trùng, khoa chẩn đoán hình ảnh và khoa truyền nhiễm của Đại Khon Kaen, 123 Mitraparp Friendship Rd, 40002 Khon Kaen, Thái Lan đồng nghiên cứu và cho thấy giun tròn Angiostrongylus cantonensis và Gnathostoma spinigerumlà hai loài ký sinh trùng phổ biến nhất gây nên viêm màng não tăng bạch cầu ái toan (Eosinophilic Meningitis_EOM) ở người. Các test huyết thanh học dùng để chẩn đoán là các công cụ hữu ích trong việc xác định bệnh nguyên. Các báo cáo gần đây đã xác định độ đặc hiệu của các test như thế có sử dụng các ca chứng là người có sức khoẻ bình thường. Có một số nghiên cứu hạn chế đã thực hiện để loại bỏ phản ứng chéo giữa 2 loại ký sinh trùng gây bệnh EOM ở người. Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá độ đặc hiệu của các test huyết thanh chẩn đoán đối với phát hiện EOM bằng cách sử dụng mỗi một trường hợp như một ca chứng với ca khác. Tổng số 33 bệnh nhân được chẩn đoán là EOM đưa vào nghiên cứu. Huyết thanh từ 22 bệnh nhân có 1 dãi băng chẩn đoán kháng nguyên 29 - kDa dương tính của A. cantonesis được thử đối chứng với dãi band kháng nguyên 21 và24-kDa cho G. spinigerum. Tương tự, huyết thanh của 11 bệnh nhân nhiễm ấu trùng giun đầu gai Gnathostomiasis được thử test cho dãi band chẩn đoán 29-kDa cho A. cantonensis. Chỉ có một bệnh nhân trong nhóm nhiễm giun Angiostrongyliasislà dương tính cho dãi kháng nguyên 21 và 24-kDa của G. spinigerum, trong khi không có bệnh nhân Gnathostomiasis chứng tỏ kết quả dương tính với dãi 29 - kDa của A. cantonensis. Độ đặc hiệu của dãi kháng nguyên 21 và 24 - kDa cho Gnathostomiasis và dãi kháng nguyên 29-kDa cho A. cantonensis là 95.5% và 100% khác nhau. Dãi kháng nguyên cho chẩn đoán Gnathostomiasis và bệnh do Angiostrongyliasis trong bệnh lý EOM là đặc hiệu rất cao. Phát hiện hay chẩn đoán bằng huyết thanh miễn dịch là một phương pháp chẩn đoán cho cả Angiostrongyliasisvà Gnathostomiasis ở người. Phát hiện sự lưu hành kháng thể chống lại cáckháng nguyên đặc hiệu là nguyên lý của test ELISA. Các dãi (band) kháng nguyên được sử dụng rộng rãi cho Angiostrongyliasisvà Gnathostomiasis là 29 và 21 hay 24-kDa, riêng lẽ (Maleewong và cs., 2001, Intapan và cs., 2010). Nghiên cứu này nhằm mục đích chứng tỏ độ đặc hiệu của các dãi chẩn đoán bởi phát hiện miễn dịch bằng huyết thanh cho bệnh Angiostrongyliasis và Gnathostomiasis trong bệnh lý viêm màng não tăng bạch cầu ái toan. Các bệnh nhân bị bệnh EOM gây ra bởiA.cantonensis sẽ được điều trị như các ca chứng trong các test chẩn đoán G. spinigerum và ngược lại Tiêu chuẩn bao gồm cho nghiên cứu là những bệnh nhân được chẩn đoán bệnh lý EOM ,có các kết quả huyết thanh học cho cả A.cantonensisvà G.spinigerum. Bệnh lý EOM được chẩn đoán nếu có hơn 10% tổng số bạch cầu ái toan trong tổng số bạch cầu trong dịch não tuỷ và nếu nhuộm dịch não tuỷ tìm vi sinh vật, các test kháng nguyên về nấm và nuôi cấy âm tính (Sawanyawisuth & Sawanyawisuth., 2008). Các trường hợp được xác định là Angiostrongyliasis nếu: (i)Có tiền sử ăn ốc, sên, tôm, cua nước ngọt sống, nhái, thằn lằn nhỏ hay các thực vật bị ô nhiễm trong 3 tháng qua; (ii)Có kháng thể huyết thanh dương tính với polypeptide 29 - kDA của A. cantonensis(Maleewong và cs., 2001). Chẩn đoán bệnh Gnathostomisasis được thực hiện nếu: (iii)Bệnh nhân có tiền sử phơi nhiễm với ấu trùng của G. Spinigerum; (iv)Có kháng thể huyết thanh dương tính với 21-kDa hay polypeptide kháng nguyên 24-kDa của G. spinigerum (Intapan và cs., 2010). (v)Tiền sử ăn hay tiếp xúc với cá nước ngọt sống, thịt gia cầm, rắn hay nhái được cân nhắc là một yếu tố nguy cơ cho Gnathostomasis; (vi)Thêm vào đó,tiền sử đau sưng khi đi lại, đau rễ dây thần kinh hay hình ảnh não bằng X quang gợi ý xuất huyết trong não giống các rãnh là các bằng chứng hỗ trợ cho Gnathostomiasis. Huyết thanh của tất cả các bệnh nhân được thử để tìm kháng thể đặc hiệu chống lại các dãi băng kháng nguyên 21 và / hay 24-kDa của A. cantonensis nhờ vào phát hiện phản ứng miễn dịch. Các phương pháp của kỹ thuật được mô tả dưới đây và bao gồm 2 bước:(i) sự tạo thành các dãi kháng nguyênbởi phương thức điện ditrên polyacrylamide gen với sự có mặt của sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, (SDS-PAGE) và (ii) phát hiện kháng thể chống lại các dãi polypeptide đặc hiệu bởi phân tích phản ứng đặc hiệu kháng nguyên- kháng thể. SDS-PAGE – kháng nguyên tế bào xôma thô của cá thể cái trưởng thành trẻ (YAF) A. cantonensis hay ấu trùng giai đoạn 3 (aL3) G. spinigerum được sử dụng kỹ thuật SDS-PAGE (Laemmni và cs., 1970) đã được chuẩn bị theo phương pháp như đã mô tả bởi Maleewong và cộng sự (2001). Tóm lại, YAF A. cantonesis từ chuột hay aL3 G. spinigerum từ chuột đã thuần chủng trong nước chưng cất chứa một hỗn hợp men protein ức chế theo sau bởi sự phân rã của các sóng siêu âm.Bề mặt của các kháng nguyên được thu thập sau khi ly tẩm sau đó protein được cô đặc và làm khô lạnh. Kháng nguyên tế bào xôma thô của A. cantonensis hay G. spinigerum sau đó được phân tách bởi phân tử khối trong 10-18% tách rời theo độ dốc hay 12 %gienSDS-PAGE riêng lẽ. Trọng lượng phân tử của các dãi polypeptide của kháng nguyên được ước tính bằng cách so sánh sự chuyển động của chúng đối với các vật liệu trọng lượng phân tử chuẩn. Kỹ thuật này bao gồm 2 bước: các vết chuyển dịch của hiện tượng điện chuyển và thử nghiệm miễn dịch enzym (EIA). Các thành tố của dãi polypeptid của mỗi kháng nguyên trên các gen theo phương pháp SDS-PAGE đã được điện chuyển các vết trên các màng tế bào nitrocellulose theo phương pháp của Towbin và cộng sự (1979) với một số thay đổi, cải tiến. Các tấm vết dịch chuyển được cắt thành các mảnh có kích thước 0,4 x 5,5 cm để phát hiện các kháng thể đặc hiệu trong mỗi mẫu huyết thanh. Tiến trình EIA trên màng nitrocellulose được xác định bởi phương pháp đã mô tả trước đó (Mallewong và cs., 2001, Laummaunwai và cs., 2007). Tóm lại, các vị trí kết nối không đặc hiệu trên dãi kháng nguyên đã được ngăn chặn bằng cách ngâm trong dung dịch 1% sữa không kem có mặt dung dịch đệm phosphat với Tween-20 trong 30 phút (dung dịch đệm ngăn cản). Sau khi rửa với dung dịch đệm ngăn cản, mỗi dãi được nuôi cấy với dung dịch pha loãng tối ưu của mỗi mẫu huyết thanh trong vòng 2 giờ. Các mảnh được rửa bởi dung dịch đệm ngăn cản, dò tìm bởi một dung dịch pha loãng tối ưu của kháng thể IgG người từ dê được dán nhãn sự kết hợp chất tẩy rửa của củ cải ngựa (Zymed Laboratories Inc) trong 2 giờ và rửa lại một lần nữa với dung dịch đệm ngăn cản. Màu sắc của các dãi polypeptide hoạt hoá trở lại phát triển sau khi phản ứng với dung dịch nền 3,3'- diaminobenzidine tetrahydrochloride trong 5 phút. Phản ứng ngừng lại bởi rửa trong DW và làm khô không khí. Mẫu huyết thanh của bệnh nhân Angiostrongyliasis hay Gnathostomiasis làm lạnh dương tính được dùng như các ca chứng dương. Các mẫu huyết thanh ở người khoẻ mạnh được làm lạnh âm tính được dùng như các ca chứng âm tính. Các ca chứng âm tính là những người không có chẩn đoán lâm sàng bệnh lý EOM và những người có kết quả âm tính chống lại các dãi kháng nguyên 21, 24 và 29-k Da. Để xác định kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên 29-kDa polypeptide của A. cantonensis, một sự pha loãng huyết thanh ở mức 1:100 và một độ pha loãng kết hợp ở mức hiệu giá 1:5,000 là dung giải tốt nhất, trong khi kháng thể đặc hiệu chống lại kháng nguyên 21 và / hay 24 - kDa polypeptide của G. spinigerum cho một dãi dung giải cao với độ hoà tan huyết thanh ở mức hiệu giá 1 : 200 và một độ hoà tan kết hợp ở mức 1:15.000. Số liệu được phân tích và cho thấy phản ứng chéo của kháng nguyên 29 - kDa polypeptide của A. cantonensis kháng lại huyết thanh của bệnh nhân nhiễm Gnathostomiasis được xác định và ngược lại. Độ đặc hiệu của mỗi dãi băng chẩn đoán được đo lường. Kết quả cho thấy trong tổng số 33 bệnh nhân được chẩn đoán là EOM được đưa vào nghiên cứu. Trong số này, có 22 bệnh nhân có kết quả dương tính với dãi chẩn đoán kháng nguyên 29-kDa của A. cantonensis, trái lại 11 bệnh nhân có kết quả dương tính với dãi kháng nguyên 21 hay 24-kDa của G. spinigerum. Huyết thanh của 22 bệnh nhân Angiostrongyliasis đã được test với dãi chẩn đoán 21 và 24-kDa của G. spinigerum. Tương tự, huyết thanh của 11 bệnh nhân Gnathostomiasis đã được test với dãi chẩn đoán 29-kDa của A. Cantonensis (thử phản ứng chéo qua lại giữa các mẫu này với nhau). Chỉ có một bệnh nhân trong nhóm Angiostrongyliasis có kết quả dương tính vớidãi kháng nguyên 21 hay 24kDa của G. spinigerum, trong khi không có bệnh nhân Gnathostomiasis chứng tỏ có kết quả dương tính với dãi kháng nguyên 29-kDa của A. cantonensis. Độ đặc hiệu của dãi kháng nguyên 21, hay24 và 29-kDa với bệnh giun đầu gai và giun mạch trong EOM là 95.5% và 100 % riêng lẽ. Bảng 1 Bảng 2 x 2 phân tích miễn dịch của dãi kháng nguyên 21 hay 24-kDa Gnathostomiasis trong viêm màng não ái toan bằng cách dùng bệnh nhân viêm màng não ái toan gây ra bới Angiostrongylus như là các ca chứng: | Gnathostomiasis ( n = 11) | Angiostrongyliasis (n =22) | Dương tính 21 hay 24-kDa | 11 | 1 | Âm tính 21 hay 24-kDa | 0 | 21 |
Bảng 2 Bảng 2 x 2 phân tích miễn dịch của dãi kháng nguyên 29-kDa Angiotrongylus cantonensis trong viêm màng não tăng bạch cầu ái toan bằng cách dùng bệnh nhân viêm màng não ái toan gây ra bới Gnathostoma spinigerum như là các ca chứng
| Gnathostomiasis ( n = 22) | Angiostrongyliasis (n = 11) | Dương tính 29 kDa | 22 | 0 | Âm tính 29 kDa | 0 | 11 |
Bệnh lý EOM ở Đông Nam Á và trên thế giới chủ yếu đựoc gây ra bởi hoặc là do loại A. cantonensis hoặc G. spinigerum (Solomon và cs., .2006). Hầu hết các nghiên cứu chẩn đoán huyết thanh học với 2 ký sinh trùng này có độ đặc hiệu rất cao khi sử dụng các cá thể bình thưòng như các ca chứng (Nopparatana và cs., 1991, Tapchaisri và cs., 1991, Eamsobhana và cs., 2001, Maleewong và cs., 2001, Anantaphruti và cs., 2005, Laummaunwai và cs., 2007, Intapan và cs., 2010). Ở đây chúng tôi xác nhận rằng dãi kháng thể 21 hay 24kDa đối với Gnathostomiasis và dãi kháng thể 29-kDa với Angiostrongylasis ở bệnh lý EOM có độ đặc hiệu cao. Gần đây, cả hai dãi kháng nguyên 21 và 24 kDa đã chứng tỏ đặc hiệu cho Gnathosomiasis thể thần kinh (Intapan và cs.,.2010). Chỉ một bệnh nhân có kết quả dương tính với 1 dãi kháng nguyên 29 - kDa với A. cantonensis có kết quả dương tính với dãi kháng nguyên 21 hay 24 kDa của G. spinigerum. Ba khả năng giải thích như sau: (i)Bệnh nhân đã bị nhiễm bởi G. spinigerum hay A. cantonensis trong quá khứ bởi vì IgG được dùng trong phân tích miễn dịch; (ii)Có thể có phản ứng chéo giữa A. cantonensis và G. spinigerum; (iii)Hoặc bệnh nhân có nhiễm phối hợp do ăn tôm sống mà nó có chứa ấu trùng của cả 2 loạiA. cantonensis và G. spinigerum. Có thể có nguyên nhân khác của viêm màng não tăng bạch cầu ái toan như là Toxocara canis hay Baylisascaris procyonis (Solomon và cộng sự., 2006). Tuy nhiên, cả hai tình trạng này là rất hiếm. Dựa vào đặc điểm lâm sàng, tiền sử phơi nhiễm với ấu trùng và vùng địa lý, hai ký sinh trùng này có thể phân biệt vớiA. cantonensis và G. spinigerum. Thêm vào đó, cả hai ký sinh trùng này rất hiếm khi gây ra viêm màng não tăng bạch cầu ái toan, chúng thường gây ra bệnh lý viêm não - màng não ái toan với biểu hiện bệnh trầm trọng hơn và hiện hữu tình trạng thay đổi tâm thần đột ngột. Hầu hết bệnh nhân bị EOM có một tình trạng tâm thần bình thường (Solomon và cs., 2006). Viêm não - màng não tăng bạch cầu ái gây ra bởi Toxocara canis đã được báo cáo ở 2 bệnh nhân trẻ em có tiền sử tiếp xúc với phân chó con (Moreira-Silva và cs.,.2004), trong khi B. procyonis cũng được báo cáo ở trẻ em có tiếp xúc với phân của gấu trúc (Chun và cs., 2009; Page và cs., 2009). Trong y văn, có một số lượng hạn chế các ca bệnhtrong đó hai ký sinh trùng này gây ra viêm màng não tăng bạch cầu ái toan. Điều rất hiếm, Paragonimus westernmani có thể là nguyên nhân gây ra viêm màng não tăng bạch cầu ái toan. Tuy nhiên, biến chứng hệ thần kinh trung ương của P. westernmani là thường đi kèm với thương tổn các hốc trong phổi và tình trạng vôi hoá não hay là sự xuất hiện của hiện tượng" bong bóng xà phòng' ( Solomon và cs.,.2006) Mặc dù, độ đặc hiệu của dãi băng kháng nguyên 29-kDa của Angiostrongyliasis là rất cao, song độ nhạy chỉ 55,6%. Một kết quả âm tính là không loại trừ trong chẩn đoán Angiostrongyliasis ở những bệnh nhân nghi ngờ về mặt lâm sàng. Hạn chế khác của nghiên cứu này là số đối tượng đựoc thử test không nhiều với tất cả dải kháng nguyên. Độ đặc hiệu của test có thể thấp hơnnếu có nhiều đối tượng được đưa vào nghiên cứu. Nghiên cứu thuần tập dài hơn có thể cần thiết để xác định kết quả. Qua nghiên cứu cho thấy các thầy thuốc lâm sàng có thể tin tưởng độ đặc hiệu của dãi kháng nguyên trong chẩn đoán A. cantonensis và G. spinigerum ở bệnh nhân có bệnh lý EOM nghi ngờ. Tài liệu tham khảo chính 1.AnantaphrutiMT,NuamtanongS,DekumyoyP 2005.Diagnostic valuesofIgG4inhumangnathostomiasis.TropMedIntHealth 2.10: 1013-1021. 3.ChunCS,KazacosKR,GlaserC,BardoD,DangoudoubiyamS,Nash R2009. Globalneurologicdeficitswithbaylisascarisencephalitis inapreviouslyhealthyteenager.PediatrInfectDisJ28:925-927. 4.EamsobhanaP,YoolekA,PunthuprapasaP, SuvoutthoS2001.A dot-blotELISAcomparabletoimmunoblotforthespecificdi- agnosisof humanparastrongyliasis.AsianPacJAllergy Im- munol19:267-273. 5.IntapanPM,KhotsriP,KanpittayaJ,ChotmongkolV,Sawanyawisuth K,MaleewongW2010. Immunoblot diagnostic test for neuro- gnathostomiasis. Am J Trop Med Hyg 83: 927-929. 6.Kuberski T 2006. Angiostrongyliasis. In RL Guerrant,DHWalker, PFWeller,Tropicalinfectious diseases:principles,pathogens and practice, Churchill Livingstone, Philadelphia, p. 1225-1230. 7.LaemmliUK1970.Cleavage ofstructuralproteinsduringtheassem- bly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. 8.Laummaunwai P, Sawanyawisuth K, Intapan PM, ChotmongkolV, WongkhamC,MaleewongW 2007.EvaluationofhumanIgG classandsubclassantibodiestoa24-kDaantigeniccomponentof Gnathostomaspinigerum fortheserodiagnosis ofgnathostomia- sis. Parasitol Res 101: 703-708. 9.MaleewongW,SombatsawatP,IntapanPM, WongkhamC,Chot- mongkol V 2001. Immunoblot evaluation of the specificity of the 10.29-kDaantigenfromyoungadultfemalewormsAngiostrongylus cantonensisforimmunodiagnosisofhumanangiostrongyliasis. Asian Pac J Allergy Immunol 19: 267-273. 11.Moreira-SilvaSF,RodriguesMG,PimentaJL,GomesCP, FreireLH, PereiraFE2004.Toxocariasisofthecentralnervoussystem:with report of two cases. Rev Soc Bras Med Trop 37: 169-174. 12.NopparatanaC,SetasubanP,ChaicumpaW,TapchaisriP 1991.Purifi- cationofGnathostoma spinigerum specificantigenandimmuno- diagnosisofhumangnathostomiasis.IntJ Parasitol21:677-687. 13.PageLK,AnchorC,LuyE,KronS,LarsonG,MadsenL,Kellner K,SmyserTJ 2009. Backyardraccoon latrinesandriskforBay- lisascarisprocyonistransmissiontohumans.EmergInfectDis 14.15:1530-1531. 15.PunyaguptaS,BunnagT,JuttijudataP1990.Eosinophilicmeningitis inThailand.Clinicalandepidemiologicalcharacteristicsof162 patientswithmyeloencephalitisprobablycausedby Gnathosto- ma spinigerum. J Neurol Sci 96: 241-256. 16.Ramirez-AvilaL,SlomeS,SchusterFL,GavaliS,SchantzPM,Sejvar J,GlaserCA2009.EosinophilicmeningitisduetoAngiostrongy- lus and Gnathostoma species. Clin Infect Dis 48: 322-327. 17.Sawanyawisuth K, Sawanyawisuth K 2008.Treatment of an- giostrongyliasis. Trans R Soc Trop Med Hyg 102: 990-996. 18.Solomon T, Danesi M, Bia FJ, Plekc TP 2006.Neurologicdisease.In RLGuerrant,DHWalker,PFWeller,Tropicalinfectiousdiseas- es: principles, pathogens and practice, Churchill Livingstone, Philadelphia, p. 1601-1608. 19.Tapchaisri P, Nopparatana C, Chaicumpa W, SetasubanP1991.Spe- cificantigenofGnathostomaspinigerumforimmunodiagnosis of human gnathostomiasis. Int J Parasitol 21: 315-319. 20.TowbinH,StaehelinT,GordonJ1979.Electrophoretictransferofpro- teinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:procedure andsomeapplications.ProcNatlAcadSciUSA76:4350-4354. 21.WangQP,LaiDH,ZhuXQ,ChenXG,LunZR 2008. Humanan- giostrongyliasis. Lancet Infect Dis 8: 621-630. 22.WilsonME,WellerPF2006.Eosinophilia.InRLGuerrant,DHWalk- er, PFWeller,Tropicalinfectiousdiseases:principles,pathogens and practice, Churchill Livingstone, Philadelphia, p. 1478-1495
|