|
Một số phương pháp-kỹ thuật trong chẩn đoán bệnh giun lươn Strongyloides stercoralis
Hiện nay không có chuẩn vàng (“gold standard”) để chẩn đoán bệnh giun lươn S. stercoralis và việc chẩn đoán vì thế trở nên trì hoãn và chậm hoặc thậm chí bỉ bỏ sót do bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng lâm sàng về tiêu hóa không đặc hiệu (non-specific gastrointestinal complaints). Các bệnh nhân mắc giun lươn mạn tính thường có mật độ hay tải lượng giun thấp và ấu trùng đào thải qua phân cũng không thường xuyên, nên khó để chẩn đoán ca bệnh. Một số phương pháp chẩn đoán đã được đưa ra so sánh để phát hiện sự có mặt S. stercoralis kể cả xét nghiệm phân, kỹ thuật Bearmann cải tiến (modified Baermann's technique), cấy phân trên đĩa thạch máu, chẩn doán miễn dịch hấp phụ men (enzyme-linked immunosorbent assay_ELISA), test phát hiện kháng thể huỳnh quang gián tiếp trên huyết thanh (serum indirect fluorescent antibody test_IFAT), chẩn đoán sinh học phân tử như phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction_PCR) và nội soi lấy dịch tá tràng, dịch ruột và sinh thiết. Tuy nhiên, tất cả kỹ thuật này có vấn đề về độ nhạy, độ đặc hiệu và tính sẵn có tại các vùng bệnh lưu hành.
Gần đây, phương pháp real-time PCR dựa trên subunit của rRNA gene để phát hiện đặc hiệu S. stercoralis DNA trong mẫu phân. Mặc dù, nó đã được giới thiệu như một phương pháp tiếp cận đầy hứa hẹn có thể giúp hỗ trợ giám sát tỷ lệ mắc thật sự và cường độ nhiễm S. stercoralis, các nhà nghiên cứu khác khuyến cáo nên đánh giá thêm. Do đó, hiện tại có nhiều nghiên cứu so sánh kỹ thuật real-time PCR với chẩn đoán mẫu phân theo phương pháp cổ điển để chẩn đoán phát hiện S. stercoralis trong phân.
Xét nghiệm phân để phát hiện các ấu trùng dạng rhabditiform larvae trong mẫu phân trực tiếp hoặc sử dụng kỹ thuật tập trung formalin-ethyl acetate. Xét nghiệm phân có độ nhạy thấp nếu chỉ lấy một mẫu phân chỉ cho độ cao nhất chỉ khoảng 30-50% dương tính trong tổng số ca mà thôi. Nghiên cứu xét nghiệm lặp lại trên nhiều mẫu phân cần thiết và quan trọng để nâng độ nhạy lên. Một kỹ thuật tập trung formalin-ethyl acetate cải tiến sẽ cải thiện và nâng cơ hội phát hiện áu trùng S. stercoralis cao hơn và cải thiện hiệu năng chẩn đoán. Phương pháp Baermann cũng sủ dụng mẫu phân để phát hiện ấu trùng giun lươn. Phương pháp Baermann có độ nhạy cao hơn phết lam phân thông thường nhưng kỹ thuật và dụng cụ cồng kềnh và hiếm khi sẵn có tại các la bô ký sinh trùng lâm sàng, đồng thời nó cũng đòi hỏi nhiều mẫu phân để cho ra độ nhạy thích hợp. Nuôi cấy trên thạch agar (nutrient agar plate), ủ mẫu ít nhất 2 ngày và đánh giá các vệt mà chúng ta có thể nhìn thấy bằng mắt thường như trên các phiến của ấu trùng mang vi khuẩn đi trên thạch. Mặc dù phương pháp nuôi cấy trên thạch agar có độ nhạy cao hơn (96%) so với phương pháp lấy mẫu phân trên lam bình thường (fecal smears) soi trực tiếp hay kỹ thuật Baermann cổ điển, nhưng đòi hỏi tính kinh nghiệm và tốn nhiều thời gian cũng như giá thành đắt hơn. Xét nghiệm ELISA để phát hiện kháng thể chống lại kháng nguyên thô tinh chiết từ ấu trùng giai đoạn “filariform larvae” trong mẫu huyết thanh và có độ nhạy cao (83-93%) và độ đặc hiệu (95-98%). Tiếc thay, sự có mặt của kháng thể không phân biệt cho chúng ta nhiễm trùng hiện tại hay đã nhiễm trong thời gian trước đây. Thử nghiệm kháng thể chống lại Strongyloides spp. Cũng có thể phản ứng chéo với một số loại nhiếm trùng giun sán khác (giun chỉ bạch huyết, giun đũa Ascaris Lumbricoides và sán máng Schistosoma spp.) nên làm giới hạn giá trị tiên đoán trong quần thể có nguy cơ cao. Ngược lại, đối với các quần thể chưa bao giờ dùng loại thuốc nào thì áp dụng xét nghiệm ELISA sẽ có giá trị chẩn đoán bệnh giun lươn. Kỹ thuật ELISA đòi hỏi một quá trình cung cấp liên tục ấu trùng giun lươn dạng “filariform larvae” vì nó có thể không thực tế có sẵn tại các phòng xét nghiệm.
Các nhà nghiên cứu Ai Cập đã phát triển một xét nghiệm ELISA bắt kháng nguyên rất thành công trong xác định kháng nguyên giun lươn trong các mẫu phân từ bệnh nhân nhiễm trùng. Xét nghiệm ELISA trên mẫu phân này không phản ứng chéo với huyết thanh của các bệnh nhân nhiễm sán máng Schistosoma mansoni, sán lá gan lớn Fasciola gigantica hay giun tròn Capillaria philippenensis. Xét nghiệm ELISA trên phân có thể cải thiện chất lượng chẩn đoán bệnh giun lươn. Một xét nghiệm gần đây mô tả sử dụng hệ thống ngưng kết miễn dịch (luciferase immunoprecipitation system) với kháng nguyên tái tổ hợp của S. Stercoralis để xác định các kháng thể đặc hiệu trong mẫu huyết thanh. Thử nghiệm này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao (độ nhạy 97% và độ đặc hiệu 100%) hơn so với xét nghiệm ELISA cổ điển và không phản ứng chéo với các mẫu huyết thanh của bệnh nhân nhiễm giun chỉ. Loại xét nghiệm này có thể thực hiện nhanh chóng (< 2.5 giờ) và có thể phát hiện sự thay đổi đáp ứng kháng thể theo thời gian trước và sau điều trị.
 | | Hình 2. Một số hình ảnh về ấu trùng và con trưởng thành giun lươn S. stercoralis |
Một phiên bản nhanh hơn của thử nghiệm này có thể thực hiện trong vòng ít hơn 2 phút và có tiềm năng sử dụng như một test chẩn đoán nhanh. Điều này rất đặc biệt trong chẩn đoán các bệnh nhân nghi ngờ có hội chứng tăng nhiễm (hyperinfection syndrome). Verweij và cộng sự đã phát triển phương pháp real-time PCR để phát hiện DNA của giun lươn S. stercoralis trong mẫu phân bằng cách sử dụng mồi và đầu dò từ trình tự gen 18s rRNA. Thử nghiệm đã thực hiện trên 145 mẫu chứng, các mẫu phân dương tính đã biết trước đó và các mẫu phân lấy từ vùng lưu hành của Ghana nơi mà bệnh giun lươn lưu hành rất cao với độ nhạy và độ đặc hiệu cao 100%. Các mẫu phân thu thập trong ethanol cho phép giữ trong điều kiện nhiệt độ phòng và vận chuyển đơn giản để xét nghiệm real-time PCR sau đó. Mặc dù khả năng có được một hệ thống PCR tại các quốc gia lưu hành bệnh là khó bảo trì trong khi nguồn lực hạn chế, thì kỹ thuật real-time PCR đóng vai trò hứa hẹn tại các quốc gia công nghiệp để phát hiện S. stercoralis và theo dõi sau điều trị. Các bệnh nhân có hội chứng tăng nhiễm và bệnh giun lươn lan tỏa có thể biểu hiện triệu chứng tiêu hóa nghiêm trọng như xuất huyết tiêu hóa hoặc loét và các triệu chứng ở đường hô hấp dẫn đến bệnh giun lươn thông qua các kỹ thuật nội soi tiêu hóa và nội soi phế quản. Đành rằng các thủ thuật này rất có hiệu quả, song chúng là các thủ thuật xâm lấn và khuyến cáo chỉ trên các bệnh nhân nghi ngờ có nhiễm trùng với tải lượng giun rất lớn. Chẩn đoán xác định giun lươn thường dựa trên việc phát hiện ấu trùng trong phân. Tuy nhiên, phần lớn các ca nhiễm là không biến chứng, lượng giun đường ruột thường thấp và lượng ấu trùng thường không đáng kể. Một số kỹ thuật đã được áp dụng để phân biệt ấu trùng trong mẫu phân, gồm có phương pháp tập trung Baermann, phương pháp tập trung formalin ethylacetate (formalin ethylacetate concentration_FEAC), phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch (agar plate culture_APC) và phương pháp nuôi cấy Harada-Mori. Nhờ vào việc áp dụng các phương pháp cổ điển, tỷ lệ phát hiện có thể thấp và cần đến nhiều mẫu phân để xét nghiệm mới mong đạt đến độ nhạy cao. Một số xét nghiệm miễn dịch đã được ứng dụng cho độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Mặc dù tại các vùng bệnh lưu hành, song về mặt đáp ứng huyết thanh học tỏ ra tốt ngay cả sau khi điều trị ca bệnh thành công, nên kỹ thuật như thế thiếu đi tính đặc hiệu do phản ứng chéo với một số loại giun sán khác như giun chỉ bạch huyết, giun đũa, sán máng.
Các nghiên cứu dựa vào quần thể, người ta tin rằng xét nghiệm phân đánh giá chưa hết tỷ lệ thật sự nhiễm giun lươn, ngược lại kỹ thuật huyết thanh học lại đánh giá quá mức tỷ lệ mắc. Song, một số kỹ thuật mới gần đây được phát triển, vào năm 2010, Ismail và cộng sự xác định và cho thấy đặc tính kháng nguyên đặc hiệu S. stercoralis antigenic epitopes và họ kết luận có ý nghĩa chỉ có các dải băng 43, 41, 36 và 32 kDa là có ý nghĩa trong chẩn đoán. Ngoài ra, xét nghiệm ELISA trên mẫu phân để chẩn đoán giun lươn Strongyloides cũng đã được giới thiệu. Các tác giả cho thấy các kháng thể tăng lên chống lại các kháng nguyên khi nghiên cứu trên ký sinh trùng ở chuột (S. ratti) có thể dùng để chẩn đoán nhiễm trùng ở người trong xét nghiệm loại antigen-captured ELISA, ngay cả độ nhạy phát hiện kháng nguyên S. stercoralis E/S (0.5 mg/ml) thấp hơn 6 lần ngưỡng phát hiện S. ratti E/S (0.08 mg/ ml). Không phát hiện phản ứng chéo với các loài giun tròn khác. Mặc khác, thử nghiệm này chỉ hiệu quả các mẫu phân không nhiễm với mẫu phân nhiễm Strongyloides khi tách mẫu phân xử lý bằng formalin và không cho dung dịch PBS. Phương pháp xét nghiệm ký sinh trùng cổ điển (Conventional parasitological methods) Mỗi mẫu phân được tập trung và xét nghiệm theo phương pháp tập trung FEAC và Baermann. Đối với APC, đĩa thạch được ủ trong điều kiện 28°C trong 2 ngày. Sự có mặt của giun lươn S. stercoralis trong đĩa thạch được phát hiện bằng mắt thường với các vệt ngẫu nhiên trên bề mặt thạch, soi dưới kính hiển vi xác định sự có mặt ấu trùng hoặc con trưởng thành còn sống di chuyển tự do. Xét nghiệm vi thể với dung dịch formalin 10% rửa trên bề mặt thạch để xác định ký sinh trùng. Trong kỹ thuật Harada-Mori, một mẫu giấy thấm lọc dùng để xử lý mẫu phân và sau đó đưa vào tube hình nón ly tâm 15ml chứa sẵn 3-4 ml nước cất ấm. Tube này được đậy lại bằng một nắp cotton và giữ tư thế thẳng đứng trong một giá đỡ ở nhiệt độ 25-28°C và giữ trong 10 ngày. Các ống tube được kiểm tra hàng ngày thông qua rút một lượng dịch nhỏ ở đáy ống và soi dưới kính hiển vi. Tiêu chuẩn chẩn đoán phát hiện ấu trùng giun lươn S. stercoralis dưới kính hiển vi như sau: Ấu trùng giai đoạn đầu (L1), ấu trùng dạng rhabditiform kích thước 200-300 μm x 16-20 μm có mọt khoang miệng ngắn, thực quản (1/3 chiều dài cơ thể) và mầm sinh dục lộ ra; Ấu trùng giai đoạn 3 (L3), có kích thước 600-700 μm x 20-24 μm, với khoang miệng chiếm 1/3-1/2 chiều dài đoạn cuối trước cơ thể, thực quản hình trụ (1/2 chiều dài cơ thể), đuôi hình V và không có vỏ bọc.
Kỹ thuật Real-time PCR trong chẩn đoán giun lươn S. stercoralisTách chiết DNA được thực hiện thông qua bộ QIAamp DNA stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Khuếch đại DNA được thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu S. stercoralis và đầu dò phát hiện đích trình tự 18S rRNA gene (GeneBank accession no. AF279916). Các cặp mồi và trình tự vật dò là:Stro18S-1530F: 5'-GAATTCCAAGTAAACGTAAGTCATTAGC-3', Stro18S-1630R: 5'-TGCCTCTGGATATTGCTCAGTTC-3' Stro18S-1586T: FAM-5'-ACACACCGGCCGTCGCTGC-3'-BHQ1. Thể tích cuối cùng 25 μl sản phẩm trộn phản ứng PCR được chuẩn bị chứa như sau: 12.5 μl PCR master mix (HotstarTaq, QIAgen, Germany), 0.3 μl (1.5 pmol) cho mỗi mồi đặc hiệu S. stercoralis (Metabion international AG, Deutschland), 0.6 μl (2.5 pmol) vật dò đánh dấu đặc hiệu S. stercoralis (Metabion international AG, Deutschland), 5 μl of DNA tách chiết từ mẫu phân và 6.3 μl nước cất. Khuếch đại bao gồm 15 phút ở nhiệt độ 95°C theo sau đó là 50 chu kỳ trong 15 giây ở 95°C và 1 phút ở 60°C. Chứng dương DNA của S. stercoralis được chuẩn bị lấy từ ấu trùng thu thập ở mẫu dương nuôi cấy. Phản ứng PCR không đưa DNA như một chứng âm. Khuếch đại, phát hiện và phân tích dữ liệu được thực hiện theo hệ thống real-time PCR và phần mềm phát hiện trình tự (SDS version 1.4_Applied Biosystems 7500®, USA). Chu kỳ ngưỡng hoặc giá trị Ct (trong PCR, số chu kỳ được báo cáo phát quan cao hơn ngưỡng phát hiện tối thiểu) của mỗi mẫu dương tính được tính.Phương pháp xét nghiệm Baermann tìm ký sinh trùng trong thực hành lâm sàngDụng cụ trong phương pháp kỹ thuật Baermann đơn giản chỉ là cái cốc ly loại ly uống rượu có chân, dùng một lần rồi bỏ và cần có một mẫu phân lớn để có cơ hội phát hiện ký sinh tùng hoặc ấu trùng cao hơn. Xét nghiệm ly tâm nổi phân (the centrifugal fecal flotation test) vẫn là loại kỹ thuật tốt nhất để phát hiện ký sinh trùng giun tròn trên người, chó, mèo bị nhiễm trùng. Tuy nhiên, một số nhiễm trùng giun tòn ít gặp hơn thì phương pháp Baermann có độ nhạy và độ chính xác cao hơn. Xét nghiệm này được sử dụng để chẩn đoán giai đoạn nhiễm trùng là giai đoạn ấu trùng hơn so với giai đoạn trứng. Xét nghiệm Baermann có khả năng nhìn thấy hình thái ký sinh trùng dễ dàng nhất và dễ thực hiện và đánh giá. Thế nhưng các test này hiếm được áp dụng.
Loại ký sinh trùng mà chúng ta thường phát hiện nhiều nhất trên phương pháp Baermann là loại Aelurostrongylus abstrusus nhiễm trên mèo và loài Strongyloides stercoralis nhiễm trên chó. Aelurostrongylus abstrusus trưởng thành tìm thấy trên các cây phế quản và các ống phế nang và lây nhiễm thông qua ăn phải các vật chủ trung gian ốc hoặc một vật chủ chim hay lòa gặm nhấm nào đó (paratenic host). Nhiễm trùng trên mèo có thể gây ra các triệu chứng từ ho cho đến viêm phế quản phổi rất nghiêm trọng. Strongyloides stercoralis tìm thấy trong ruột non và có thể nhiễm trên chó theo một số đường, kể cả xuyên da và lan truyền qua sữa mẹ.
Nhiễm trùng Strongyloides stercoralis có thể gây tiêu chảy nhưng vì ấu trùng di chuyển qua hô hấp phổi cũng có thể xảy ra. Phương pháp Baermann có thể sử dụng để phát hiện ký sinh trùng trên chó loài giun Crenosoma vulpis và Angiostrongylus vasorum, nhưng các ký sinh trùng này phân bố rất giới hạn ở vùng Bắc Mỹ. Tại sao ly tâm phân ít có hiệu quả? Giun cái Aelurostrongylus abstrusus và S. stercoralis đẻ trứng và đẻ rất nhanh, dẫn đến giai đoạn ấu trùng từ vật chủ. Các ấu trùng này có thể tìm thấy dựa vào xét nghiệm thường quy làm nổi phân, nhưng các dung dịch làm nổi có đặc tính “hyperosmotic flotation solution” sẽ nhanh chóng làm xoắn vặn chúng, khiến cho hình ảnh đặc hiệu khó xác định. Phương pháp Baermann cho phép phục hồi các ấu trùng này mà không cần cho chúng phơi nhiễm với các dung dịch phá hủy. Thử nghiệm Baermann cũng cho phép một lượng lớn phân chứ không như test làm nổi phân. Vì ấu trùng có thể có mặt với một số lượng nhỏ hoặc xuất hiện từng đợt nên nếu xét nghiệm có cơ hội tìm thấy thì cần một lượng phân lớn. Quy trình thực hiện xét nghiệm Baermann? Trước đây, xét nghiệm Baermann đòi hỏi trang thiết bị phức tạp và không phải áp dụng thường quy trong chẩn đoán thực hành tại các bệnh viện. Hiện nay chỉ cần có các thiết bị đặc chủng chuyên dụng như các cốc dạng ly rượu có đế chân bằng nhựa để làm xét nghiệm. Một mẫu phân được huyền phù trong nước để trong một cái bát thủy tinh để trong thời gian ít nhất 8 giờ, để cho các ấu trùng trong mẫu phân có cơ may đi ra khỏi khối phân và vào trong nước, di chuyển một cách ngẫu nhiên. Ấu trùng không thể bơi và rơi xuống đáy của phần trũng sâu của cốc thủy tinh-nơi mà chúng có thể thu lại để soi dưới kính hiển vi. Xét nghiệm Baermann này đòi hỏi mẫu phân tươi (thu thập ngay sau khi vật chủ đại tiện). Khi phân đi ra ngoài đất nó có thể nhiễm với các loại giun tròn khác đang còn sống thì khi đó chúng ta cũng phát hiện được, dẫn đến khó có thể phân biệt với các loại ấu trùng của ký sinh trùng khác. Ngoài ra, trứng giun móc có thể tạo phôi và đẻ ra trong một thời gian ngắn ở điều kiện thời tiết ấm ẩm. Ấu trùng giun móc giai đoạn đầu cũng sẽ được tìm thấy nhờ vào xét nghiệm Baermann và có thể khó phân biệt với ấu trùng giun lươn Strongyloides. Một mẫu phân thu thập tươi nhưng để đông lạnh trong một thời gian dài (nhiều ngày) cũng không nên vì ấu trùng có thể chết và xét nghiệm cần đòi hỏi sự có mặt ấu trùng còn sống.
 | | Hình 1. Một số quy trình kỹ thuật liên quan đến phương pháp Baermann’s |
Cấy phân để tìm ấu trùng giun lươn đường tiêu hóa (Copro-culture for S. stercoralis) Giun lươn Strongyloides stercoralis có diện phân bố rộng tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới cũng như một số vùng ôn đới trên thế giới. Con người nhiễm phải có thể qua các con đường trực tiếp qua đường xuyên da bới ấu trùng giai đoạn L3 của giun lươn. Tại Ý, có một số vùng lưu hành ở đồng bằng Padania. Tại Ý, bệnh giun lươn thường xảy ra trên quần thể người vì thế hệ trẻ làm ruộng và các thế hệ trẻ làm các công việc khác liên quan đến nông nghiệp. Mặc dù, nhiễm trùng thường không triệu chứng, nên các cá nhân nhiễm phải có thể có triệu chứng đau bụng, cơn khó thở dạng hen, ngứa toàn thân và có tổn thương da.
A. Di chuyển của ấu trùng Strongyloides hình rắn bò có thể nhìn thấy như cụm vi khuẩn di chuyển thành các vệt dài trên thạch nuôi cấy đờm màu chocolate. Mẫu này thu nhận từ một bệnh nhân đã tử vong do bệnh giun lươn lan tỏa khi dùng thuốc corticosteroids để điều trị u não.
B. Làm rõ hình bên thấy các vạch rõ ràng của cụm vi khuẩn do ấu trùng giun lươn di chuyển. |
Vì tầm quan trọng của chẩn đoán ca nhiễm trùng không triệu chứng ở các cá nhân suy giảm miễn dịch hoặc đang điều trị các khối bệnh lý ác tính, cần thiết chỉ định xét nghiệm phân trực tiếp, kèm theo nuôi cấy phân. Nhóm nghiên cứu đã nuôi cấy trên thạch với 10 đĩa khác nhau để làm tăng độ nhạy phát hiện nhiễm trùng.
Mẫu bệnh phẩm là mẫu phân tươi thu thập từ 24 giờ trước đó và giữ ở nhiệt độ phòng (không đông lạnh). Số lượng phân tối thiểu cần là 50ml (tương đương ½ cốc nước). Phương pháp phân tích nuôi cấy trên 10 đĩa thạch khác nhau với than hoạt tính (Agar plate culture with activated charcoal). Chẩn đoán phân tử trên mẫu phân bằng kỹ thuật real-time PCR đối với giun lươn (Molecular diagnosis of S. stercoralis in faecal samples using real-time PCR). Nhóm tác giả Jaco J Verweij, Marco Canales, Katja Polman, Juventus Ziem, Eric A T Brienen, Anton M Polderman, Lisette van Lieshout đăng tải trên tạp chí Trans R Soc Trop Med Hyg 2009 Apr 4;103(4):342-6. Epub 2009 Feb 4 về kết quả nghiên cứu này.
Phương pháp real-time PCR nhắm vào đích của tiểu đơn vị nhỏ subunit của rRNA gene để phát hiện Strongyloides stercoralis DNA trong các mẫu phân, gồm có cả các mẫu chứng nội để phát hiện sự ức chế tiến trình khuếch đại. Thử nghiệm được thực hiện trên các mẫu chứng (n = 145), mẫu phân dương tính đã biết trước đó (n = 38) và mẫu phân từ lấy từ các vùng lưu hành của khu vực Bắc Ghana - nơi có sự lưu hành của nhiễm trùng S. stercoralis (n = 212) và kết quả cho thấy độ đặc hiệu 100% và độ nhạy cao. Việc sử dụng thử nghiệm này có thể hỗ trợ giám sát tỷ lệ mắc bệnh và cường độ nhiễm S. stercoralis trong chương trình can thiệp giun sán quốc gia.
Hơn nữa, sử dụng thử nghiệm này cho các la bô chẩn đoán có thể giới thiệu một loại chẩn đoán mức độ phân tử khả thi như một xét nghiệm thường quy cho bệnh nhiễm trùng S. stercoralis, tăng gấp đôi tỷ lệ phát hiện so với các phương pháp lắng cặn thường dùng của Baermann. Các bạn đọc có thể tham khảo và làm tư liệu về ấu trùng giun lươn di chuyển, xin xem videoclip Larva of strongyloides stercoralis in stool- high power microscopy (https://www.youtube.com).
|
TRANG CHỦ
