Huỳnh Ly Na^1,2,3, AdamaZanDiarra^1,2 , Nguyễn Hồng Sang³ , Trần Long Biên³, Đỗ Văn Nguyên³, Lý Trần Đức Anh^1,2, Hồ Văn Hoàng³ , Nguyễn Xuân Quang³, và Philippe Parola^1,2*

Giới thiệu: MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometry: phương pháp đo khối phổ ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và năng lượng laser) là một cuộc cách mạng trong vi sinh học lâm sàng và gần đây đã được mô tả như một phương pháp tiếp cận sáng tạo và hiệu quả để định danh các loài động vật chân khớp.

Phương pháp: Trong nghiên cứu này, muỗi được bắt ở Việt Nam bằng bốn phương pháp khác nhau (mồi người, bẫy đèn ánh sáng CDC, bẫy BG-Sentinel, bẫy màn bằng gia súc). Tổng cộng 4.215 cá thể muỗi được bắt và xác định hình thái học, thuộc ba giống: Aedes, Anopheles và Culex. Chúng tôi chọn ngẫu nhiên 1.253 cá thểmuỗi, bao gồm 662 cá thểcủa 14 loài Anopheles, 200 của hai loài Aedes và 391 cá thể Culex không được định danhbằng hình tháihọc đến mức độ loài, để phân tích sinh học phân tử và MALDI-TOF MS. DNAcủa 98 cá thể muỗi (69 Anopheles, 23Culex và 6 Aedes) được phân tích sinh học phân tử để giám định độ chính xác của các kết quả định danh loài bằng hình thái học và bằng công cụ MALDI-TOF MS, cũng như để định danh các loài Culexchỉ ở mức độ giống vàsự khác biệt giữa định danhbằng hình thái và MALDI-TOF MS.

Kết quả: 1.058 trong số 1253 mẫu (84%) cho thấy các phổMS có chất lượng cao, bao gồm 192/200 đối với Aedes, 589/662 Anopheles, và 277/391 Culex. Thử nghiệm mù (blind test) cho thấy 986/997 (99%) mẫu đã được định danh chính xác bằng MALDI-TOF MS, với các giá trị điểm số có tính logic (log score values: LSVs) từ 1.708 đến 2.843. Mười một mẫu Culex không thể được định danh dựa trên các đặc điểm hình thái, MALDI-TOF MS hoặc sinh học phân tử.

Kết luận: Nghiên cứu này cho phép chúng tôi xác định một số loài muỗi từ Việt Nam bằng MALDI-TOF MS và làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu về các khối phổ tham chiếu MALDI-TOF MS của chúng tôi.

Từ khóa: MALDI-TOF MS; sinh học phân tử; muỗi; Việt Nam.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Muỗi là một trong những loài côn trùng có vai trò y học quan trọng nhất trên thế giới,với xấp xỉ 3500 loài được công nhận hiện nay [1]. Ở Việt Nam, có 255 loài muỗiđược ghi nhận, thuộc 42 phân giống và 21 giống [10]. Phần lớn thuộc ba giống là Aedes, Anopheles và Culex, và bao gồm các véc-tơ của các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm [11]. Số lượng loài được phát hiệnngày càng tăng, một số loài khó phân biệt với những loài khác hoặc không thể phân biệt được về mặt hình thái bằng các phương pháp định loại truyền thống [12]. Các kỹ thuật sinh học phân tử, chẳng hạn như điện di enzyme và phân tích PCR, đã được sử dụng để phân biệt giữa các loài đồng nhất [13, 14]. Tuy nhiên, các kỹ thuật này có một số hạn chế như tiêu tốn nhiều thời gian, chi phí cao và đặc biệt cần phải có các trình tự gen được khuếch đại, vốn không có sẵn cho một số loài trong cơ sở dữ liệu của Ngân hàng Gen (GenBank) [15, 16].

Các nghiên cứu gần đây cho thấy phương pháp đo khối phổ MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) có thể là một công cụ nhanh chóng và chính xác để định danh các loài động vật chân khớp, nguồn máu vật chủcủa chúng và các vi sinh vật liên quan [17– 19]. So với giải trình tự, MALDI-TOF MS là một kỹ thuật dễ sử dụng, tiết kiệm thời gian và chi phí trong côn trùng học, đặc biệt nếu có sẵn một máy được mua để sử dụng cho vi sinh [20, 21]. Đây là một kỹ thuật dựa trên việc xác định các protein có trong một mẫu cần được phân tích. Tỷ lệkhối lượng trên điện tích m/z (mass/charge ratio) của mỗi protein được đo lường khi nó vượt qua một trường điện từ sau khi đẩy các phân tử protein bằng tia laser cực tím. Do đó, tỷ lệ m/z của các protein được đo tạo ra một khốiphổ protein đặc trưng của mẫu, được gọi là “dấu hiệu protein” (protein signature). Phổ này sau đó được so sánh với một cơ sở dữ liệu tham chiếu có chứa các phổ của các loài đã được định danh bằnghình thái học, MALDI-TOF MS, và giám định bằng sinh học phân tử [21]. Trong côn trùng y học, việc lựa chọn bộ phận cơ thể của động vật chân khớpvà phương pháp bảo quản là những thông số có thể ảnh hưởng đến chất lượng của phổ [17]. Tuy nhiên, việc lựa chọn bộ phận cơ thể được sử dụng để phân tích MALDI-TOF MS phụ thuộc vào loại động vật chân khớp, chẳng hạn như sử dụng chân đối với muỗi và ve [20, 22, 23], đầu đối với con rệp [24] và phần đầu-ngực-chân(cephalothorax) cho chấy và rận [25]. Kỹ thuật liên quan tới protein này đã khắc phục được những hạn chế của các phương pháp định danh hình thái và sinh học phân tử truyền thống vì không đòi hỏi kiến ​​thức côn trùng học chuyên sâu và có thể làm giảm đáng kểthời gian và chi phí liên quan [14, 21, 26].

Mục đích của nghiên cứu này là ứng dụng MALDI-TOF MS để định danh một số loài muỗi được thu thập ở Việt Nam nhằm tạo cơ sở dữ liệu tham chiếu cho việc định loại loài nhanh và chính xác.

PHƯƠNG PHÁP

Thu thập muỗi và xác định hình thái

Tất cả muỗi được các nhà côn trùng học của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn thu thập vào đầu mùa mưa (tháng 5) và đầu mùa khô (tháng 1) của năm 2018 - 2020 tại miền Trung-Tây Nguyên Việt Nam. Khu vực thu thập muỗi bao gồm 8 tỉnh: Hòa Vang(Đà Nẵng),Nam Giang (Quảng Nam), Vân Canh (Bình Định), Đồng Xuân (Phú Yên),Ea Kar (Đắk Lắk), Krông Pa (Gia Lai), Khánh Vĩnh (Khánh Hòa) và Hàm Thuận Nam (Bình Thuận) (Hình 1).

Công tác thu thập muỗi được thực hiện trong tám ngày/đêm liên tục bằng bốn phương pháp khác nhau: mồi người (human landing catch_HLC), bẫy đèn CDC (CDC light trap_CDC-LT), bẫy màn gia súc(animal-baited net trap) và bẫy muỗi Biogents Sentinel (BG-Sentinel; BioGents AG, Regensburg, Đức). Thu thập muỗi diễn ra trong rừng, nhà và chòi và xung quanh nhà của người dân địa phương, để bắt muỗi đại diện cho một số lượng lớn về cácgiống và loài. Mồi ngườingày/đêm cả trong và ngoài nhà.

Muỗi Anopheles và Aedes được định danh về mặt hình thái ở cấp độ loài và muỗi Culex được xác định ở cấp độ giống bằng các khóa định danh muỗi Việt Nam [27–30]. Chỉ những con muỗi cái mới được sử dụng trong nghiên cứu này và các mẫu bắt được, được bảo quản trong silica gel (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Đức), hoặc đông lạnh ở -20°C, trước khi được gửi đến Viện Nghiên cứu các bệnh truyền nhiễm Địa Trung Hải (Institut Hospitalo-Universitaire IHU Méditerranée Infection) Marseille, Pháp để phân tích. Các mẫu được lưu trữ và sau đó được phân tích trong khoảng thời gian từ 1 đến 2,5 năm.

Xác định sinh học phân tử muỗi và phân tích cây phát sinh loài

Toàn bộ DNAđược tách chiết bằng máy BioRobot EZ1 (QIAGEN, Hilden, Đức) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đầu-chân-ngực của mỗi cá thể muỗi được đặt trong các tuýp Eppendorf chứa 180 µl dung dịch đệm G2 và 20 µl proteinase K và các mẫu được ủ ở 56°C qua đêm. Tách chiết DNAtừ 200 µl dung dịch ủ, 100 µl DNA tách được sẽ được bảo quản ở -20°C.

DNA của 98 cá thểmuỗi, bao gồm 43 cá thểcócác phổ của chúng đã được sử dụng để tạo cơ sở dữ liệu MALDI-TOF MSvà 55 cá thể được chọn để kiểm chứng chất lượng định danh bằngMALDI-TOF MS của chúng tôi, đãđược giám định bằng sinh học phân tử. Nhóm 55 con muỗi được chọn để đối chứng chất lượng của phương pháp định danhMALDI-TOF MS, gồm có 34 cá thể cóđịnh danh bằng MALDI-TOF MS đồng nhất vớiđịnh danh hình thái và 21 cá thể có định danhbằng MALDI-TOF MS khác biệt với định danh hình thái của chúng tôi. Phân tích standard PCR và giải trình tự bằngsử dụng gen cytochrome C oxidase I (COI) [mồi xuôi COI_1 (LCO1490): 5′-GGT CAA ATC ATA AGA TAT TGG-3 ′; mồi ngược (HC02198): 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3 ′] với vùng khuếch đại720-bp [31]. Chúng tôi cũng giải trình tự đoạn COI 720-bp của 34 mẫu của các loài muỗi khác nhau để khẳng định rằng định danh bằng MALDITOF MS của chúng tôi bằng sử dụng cùng một loại mồi. Các mẫu mà chúng tôi không giải trình tự thành công bằng gen COI_1, sau đóđược thực hiện thành côngbằng standard PCR và giải trình tự khác, bằng sử dụng COI_2 [đoạn mồi chuyển tiếp (CI-J-1632): 5′-TGATCAAAAAATTTATAAT-3 ′; mồi ngược (CI-N-2191): 5′-GGGGTAAAAAAAATA TAAACTTC-3 ′] khuếch đại trình tự một phần 560-bp [32]. Chúng tôi đã sử dụng gen acetylcholinesterase 2 (Ace2) [mồi trực tiếp (ACEpip): 5′-GGAAAACAAACGACGT ATGTACT-3 ′; mồi ngược (B1246s): 5'-TGGAGC CTCCTCTTCACGGG-3 ′] khuếch đại đoạn 610-bp của Culex pipiens và đoạn 274-bp của Culex quinquefasciatus để phân biệt hai loài [33].

Đối với các mẫu Anopheles maculatus sensu lato (sl) không được định danh bằng MALDI-TOF MS, chúng tôi thực hiện kỹ thuật standard PCR và giải trình tự nhắm vào một phần đệm phiên mã bên trong 459-bp 2 (ITS2) [mồi thuận (5.8F): 5′- TGTGAACTG CAGGACACATG-3 ′; mồi ngược (28R): 5′-ATGCTTAAATTTAGGGGG TA-3 ′] [34].

Phương pháp Standard PCR và giải trình tự gen được thực hiện như mô tả trong các nghiên cứu trước đây [23]. Chứng âm (hỗn hợp PCR đơn và nước vô trùng) và chứng dương (DNA tách chiết từ ​​Anopheles gambiae và Ae. Albopictusđược định danh và nuôi giữtrong phòng thí nghiệm-IHU), được đưa vào mỗi lần chạy PCR. Các trình tự thu được, được tập hợp và phân tích bằng phần mềm ChromasPro (phiên bản 1.77) (Technelysium Pty Ltd., Tewantin, Australia) và được gửi lên trang web NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) để phân tích. Câyphát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm Mega 7.0 (https: //www.megasoftwa re.net) [35]. Các phân tích được thực hiện bằng sử dụng phương pháp Maximum Likelihood (ML)do MEGA 7 đề xuất và các phân tích bootstrap được lặp lại 500 lần.

Chuẩn bị muỗi để phân tích MALDI‑TOF MS

Muỗi với ít nhất ba chân đã được chọn để phân tích MALDI-TOF MS. Từng cá thể muỗi được xử lý riêng lẻ bằng cách nghiền các chân trong ống Eppendorf có thể tích 1,5 ml chứa 15 μl axít formic 70% (v/v) (SigmaAldrich, St. Louis, MO, Mỹ) và 15 μl 50% (v/v) ) acetonitril (Fluka, Buchs, Thụy Sĩ), với các hạt thủy tinh có đường kính 1,0 mm (Sigma France, Lyon, France) bằng máy nghiềnTissue lyser (Qiagen) với các tham số tối ưu được thiết lập trước đó [36]. Sau khi ly tâm, nhỏ mỗi 1μl hỗn dịch của mỗi mẫu lên 4 ô (spots) trên đĩa thép MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Wissembourg, Pháp), để khô, sau đó tiếp tục phủ dung dịch matrix gồm 1μl-cyano-4-hydroxycynnamic axit bão hòa (Sigma, Pháp), 50% acetonitril (v/v), 2,5% axit trifluoroacetic (v/v) (Sigma-Aldrich Co. Ltd., Gillingham Dorset, Anh) và nước sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography-grade water) [19, 37]. Đĩa MALDI-TOF MS được để khô tự nhiện tại nhiệt độ phòng trước khi được đưa vào máy đo khối phổ Microflex LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics) để phân tích. Chất lượng của matrix, mẫu cần phân tích và hiệu suất của công cụ MALDI-TOF được kiểm chứng bằng muỗi Aedes albopictus nuôi giữ trong phòng thí nghiệm (chứng dương).

Các thông số MALDI‑TOF MS

Các cấu hình quang phổ thu được từ chân muỗi được hiển thị bằng máy đo khối phổ Microflex LT MALDI-TOF với phần mềm FlexControl (phiên bản 3.3; Bruker Daltonics). Quang phổ thu được ở chế độ tuyến tính dương ở tần số lazer 50 Hz. Điện áp tăng tốc là 20 kV và thời gian trì hoãn phân tách protein là 200 ns. Mỗi quang phổ tương ứng với các ion thu được từ 240 lần chụp laser được thực hiện ở sáu vùng tại cùng một vị trí và được thu tự động bằng phần mềm AutoXecute Flex Control (phiên bản 2.4; Bruker Daltonics). Các cấu hình MS được hiển thị bằng phần mềm FlexAnalysis v3.4, MALDI Biotyper Compass Explorer v4.1.70 (Bruker Daltonics) và phần mềm ClinProTools v3.0 (Bruker Daltonics) được sử dụng để xử lý dữ liệu.

Phân tích quang phổ và tạo cơ sở dữ liệu tham chiếu

Tất cả các quang phổ được hiển thị trực quan bằng phần mềm FlexAnalysis v.3.3 để kiểm tra chất lượng, sự lập lại và tính đặc trưng của chúng. Quang phổ có chất lượng kém, tức là những quang phổ có cường độ thấp (<3000 AU), không có tính lập lạigiữa các spots trong cùng loài và gây nhiễu, bị loại khỏi nghiên cứu. Cuối cùng, thực hiện phân tích cụm để trực quan hóa sự lập lại và tính đặc trưng của phổ bằng chức năng biểu đồphân nhánh Dendrogram cấu hình phổ MSP (Main Spectrum Profile_MSP) của phần mềm MALDI Biotyper Compass Explorer v4.1.70. Biểu đồ dendrogram được xây dựng từ hai đến ba phổ đại diện cho mỗi loài, ngoại trừ Anopheles barbirostris và Culex pallidothorax chỉ có một phổ cho mỗi loài. Biểu đồ MS dendrogram là kết quả của việc so sánh các MSP được tạo ra bởi phần mềm MALDI Biotyper và được nhóm lại theo cấu hình đặc trưng của các protein (tức là các tín hiệu phổ và mật độ của cấu hình protein), và biểu đồ MS dendrogramnày minh họa các mẫu liên quan với nhau như thế nào. Các biểu đồ MS dendrogramđã giúp chúng tôi chọn các khối phổ tham chiếu đại diện cho các loài [23]. Sau đó, từ một đến bốn phổ tham chiếu cho mỗi loài được bổ sungcác khối phổ tham chiếu MS vào cơ sở dữ liệu về động vật chân khớp của chúng tôi [20]. Tuy nhiên, phổ tham chiếu của Anopheles kochi và Anopheles jeyporiensis không được thêm vào cơ sở dữ liệu vìAn. kochi chưa được giám địnhbằng sinh học phân tử và phổ của An. jeyporiensis có chất lượng kém.

Thử nghiệm mù (blind test) để xác định các loài muỗi

Khối phổ MS củaAe. albopictus, Ae. aegypti và Culex spp. đã được thử nghiệm mù dựa trên cơ sở dữ liệu có chứa các phổ của Ae. albopictus, Ae. aegypti, Cx. quinquefasciatus và Culex sitiens, phổ tham chiếu này đã có trong cơ sở dữ liệu MALDI-TOF MS của chúng tôi. Đối với các mẫu Culex spp. đã không được định danh tại lần thử nghiệm mù (Blind test) lần thứ nhất và loài Anopheles, một thử nghiệm mùlần thứ hai được thực hiện với các phổ còn lại, sau khi tạo cơ sở dữ liệu về các phổ tham chiếu của các loài khác nhau được định danh vềkỹ thuậtsinh học phân tử. Tổng cộng 43 mẫu vật, bao gồm từ một đến bốn mẫu mỗi loài, đãđược sử dụng để tạo cơ sở dữ liệu phổ MALDITOF MS về muỗi ởViệt Nam.

Độ tin cậy của định danh loài được xác định bằng các giá trị điểm logic (LSVs) từ 0 đến 3 bởi phần mềm MALDI-TOF Biotyper, tương ứng với mức độ tương đồng giữa phổ được truy vấn và phổ tham chiếu có sẵn trong cơ sở dữ liệu. Điểm ngưỡng LSV được thiết lập để xác định đúng loài muỗi là 1,70.Trong nghiên cứu này, đây là giá trị ngưỡng tối ưu được áp dụng để định danh động vật chân khớp bằng công cụ MALDI-TOF MS [38,39].

KẾT QUẢ

Thu thập muỗi và xác định hình thái

Tổng số 4.215 cá thể muỗi đã được thu thập bằng các phương pháp khác nhau, bao gồm 1.301 mẫu muỗi (30,9%) bằng mồi người(HLCs), 1.335 mẫu (31,7) bẫy đèn(CDC-LTs), 891 mẫu (21,1%) bẫy màngia súc và 688 mẫu (16,3%) bẫy BG-Sentinel. Muỗi được thu thập bằng CDC-LTs, HLCs và bẫy màngia súc có số lượng và thành phần loài phong phú hơn so với bắt muỗi bằng bẫy BG-Sentinel. Số lượng mẫu muỗi thu được ở mỗi tỉnh là: Đà Nẵng (n = 902), Quảng Nam (n = 220), Bình Định (n = 1098), Gia Lai (n = 473), Đắk Lắk (n = 233), Phú Yên (n = 899), Khánh Hòa (n = 209) và Bình Thuận (n = 181) (Bảng 1; Hình 1; Tệp bổ sung 1: Bảng S1). Hai loài Aedes được xác định về mặt hình thái: Ae. aegypti (n = 507; 12%) và Ae. albopictus (n = 640; 15,2%). Mười bốn loài Anopheles được xác định dựa trên các đặc điểm hình thái: Anopheles aconitus (n = 15; 0,4%), Anopheles annularis (n = 3; 0,1%), Anopheles barbirostris (n = 7; 0,2%), Anopheles dirus s.l. (n = 281; 6,7%), An. kochi (n = 8; 0,2%), An. maculatus s.l. (n = 1062; 25,2%), Anopheles minimus s.l. (n = 183; 4,2%), An. jeyporiensis (n = 1; 0,02%), Anopheles peditaeniatus (n = 81; 1,9%), Anopheles sinensis (n = 11; 0,2%), Anopheles splendidus(n = 36; 0,8%), Anopheles jamesii (n = 49; 1,2%), Anopheles vagus (n = 35; 0,8%) và Anopheles varuna (n = 9; 0,2%). Culex spp.,gồm 1.287 cá thế (30,7%), không được định danh đến cấp độ loài vì các đặc điểm hình thái đặc trưng bên ngoài của chúng, bị hư hại trong quá trình thu gom, vận chuyển hoặc bảo quản.

Định loại muỗi MALDI‑TOF MS

Trong số 4.215 cá thể muỗi thu thập được, có 1.253 (30%) cá thể muỗi, bao gồm 662 mẫu Anopheles spp., 391 mẫu Culex spp. và 200 mẫu Aedes spp., được chọn ngẫu nhiên để phân tích MALDI-TOF MS (Bảng 2). Nhìn chung, tổng 1,253 cá thể muỗi được phân tích bằng MALDI-TOFMSthì1,058 (84%) cá thể muỗi cho thấy các sóng quang phổ MS chất lượng cao, cao nhất là Aedes spp.,với tỉ lệ chất lượng quang phổ tốtchiếm 96% (192/200), tiếp theo là Anopheles spp. 88,97%(589/662) và Culex spp. 70,84%(277/391). Về mặt trực quan, so sánh các cấu hình MS chân của các loài khác nhau sử dụng phân tích FlexControl cho thấy sự lặp lại của các loàitrong cùng loài và sự đặc trưng giữa các loài khác nhau. Các cấu hình protein MS của từ hai đến ba mẫu vật của mỗi loài muỗi được sử dụng để tạo ra một biểu đồ MSP cho thấy, một nhóm các mẫu vật từ cùng một loài được nhóm lạitrên cùng một nhánh (Hình 2). Cường độ đỉnh phân biệt trung bình của 19 loài muỗi, trừ những loài có số lượng thấp, được thể hiện trong tệp Phụ 3: Bảng S2.

Bảng 1. Số lượng và thành phần muỗi được thu thập bằng các phương pháp khác nhau ở Việt Nam từ tháng 5 năm 2018 đến tháng 1 năm 2020

Bảng 2. Số lượng mẫu của mỗi loài muỗi được định danh hình thái học được chọn ngẫu nhiên để phân tích MALDI-TOF MS, tạo cơ sở dữ liệu tham chiếu và kết quả thử nghiệm mù của định danh MS và giá trị điểm logic của từng loài.

^aCác loài đã có sẵn trong cơ sở dữ liệu của chúng tôi

( ) các giá trị trong ngoặc đơn: số lượng mẫu của mỗi loài được xác định bằng MALDI-TOF MS

Ghi chú: số lượng: SL, phân tích: PT, thu thập: TT, định loại: ĐL

Truy vấn 192 phổ chất lượng cao của Aedes spp. dựa trên cơ sở dữ liệu MALDI-TOF MS nội bộ của chúng tôi cho thấy 94 phổ là Ae. albopictus và 98 là Ae. aegypti, với giá trị LSV nằm trong khoảng từ 1,729 - 2,39 (Bảng 2). Đối với Anopheles spp., chúng tôi đã bổ sung28 phổ tham chiếu từ một đến bốn phổ của mỗi loàiđãđược giám định bằng phân tích sinh học phân tửvào cơ sở dữ liệu MALDI-TOF MS của chúng tôi, cơ sở dữ liệu này không chứa phổ của các loài liên quan. 561 phổ còn lại sau đó được thử nghiệm mù dựa trên cơ sở dữ liệu cập nhật, cho thấyxác định chính xác 96,8% (543/561), tức là thể hiện sự trùng khớp giữa định danh bằnghình thái họcvà kết quả MALDI-TOF MS. Các giá trịLSVs của các mẫu Anopheles spp.dao động từ 1.708 đến 2.821 (Bảng 2). Đối với 18 mẫu còn lại (3,2%), có sự khác biệt giữa định danhhình thái và định danhMALDI-TOF MS. Phân tích sinh học phân tử đãxác nhận định danhMALDI-TOF MS của tất cả các loài, ngoại trừ các mẫu của An. maculatus s.l. Biểu đồ dendrogram được phát ra từ phổ của các loài muỗi được xác định là An. maculatus s.l. cho thấy rằng chúng tạo thành hai nhánh riêng biệt (Hình 3).

Hình 2. Biểu đồ biểu diễn cây Dendrogram được xây dựng từ hai đến ba phổ
đại diện của các loài muỗi khác nhau được thu thập tại Việt Nam từ tháng 5 năm 2018 đến tháng 1 năm 2020.
Biểu đồ dendrogram được phân tích bằng phần mềm Biotyper v3.0 và các đơn vị khoảng cách tương ứng với độ tương đồng của phổ MS.
Các đường màu đỏ thể hiện mức phân nhánh giữa các giống muỗi.
Các đường màu tím cho thấy mức phân nhánh giữa các loài Anopheles khác nhau.
Các đường màu xanh lam và màu xanh lá cây cho thấy mức phân nhánh tương ứng giữa các loài Culex vàAedes.

Truy vấn 277 chân của Culex spp. dựa trên cơ sở dữ liệu của chúng tôi có chứa các khối phổ của 17 loài Culex cho thấy, đã xác địnhđược28,2% (78/277), bao gồm 48 mẫuCx. quinquefasciatus và 30 mẫu Cx. sitiens, với các giá trị LSVs lần lượt từ 1.725 - 2.401 và từ 1.737 - 2.144. Từ 199/277 chân còn lại của Culex spp. chưa được xác định, chúng tôi đã chọn ngẫu nhiên 15 trong số 199 mẫu Culex để tạo cơ sở dữ liệu của chúng tôi với phổ tham chiếu của bốn Culex tritaeniorhynchus, bốn Culex pseudovishnui, bốn Culex vishnui s.l., hai Culex fuscocephala và một Culex pallidothorax được xác định bằng sinh học phân tử. Thử nghiệm mù lần thứ hai đối với 184 phổ còn lại dựa trên cơ sở dữ liệu cập nhật cho thấy,đã xác địnhđược92,4% (170/184), với LSVs nằm trong khoảng từ 1.739 - 2.843. Trong số 173 con muỗi Culex đã được xác định, 58 mẫu là Cx. tritaeniorhynchus, 46 mẫu là Cx. pseudovishnui, 44 mẫu là Cx. vishnui s.l. và 25 mẫu là Cx. fuscocephala (có 3 mẫu cho thấy sự khác biệt giữađịnh danh bằnghình thái vớikết quả MALDI-TOF MS, sau đó được giám định bằng phân tích phân tử). Cuối cùng, có tổng cộng 11 mẫu vật có phổ chất lượng cao không được xác định bằng MALDI-TOF MS và cũng không thể được kiểm chứng bằng sinh học phân tử. Mặc dù, các mẫu này đã được giải trình tự với cả ba loại gen (Tệp bổ sung 4: Hình S2).

Định loại phân tử muỗi

Việc xác định trình tự và BLAST của trình tự gen COI_1 hoặc COI_2 từ các loài Anopheles và Aedes được chọn cho cơ sở dữ liệu cho thấy khả năng xác định loài đáng tin cậy và nhất quán theo định danh hình thái, với mức độ nhận dạng các trình tự DNA trên Ngân hàng Gen (GenBank) từ 98,4 đến 100% (Bảng 3). Sử dụng gen COI_1 để định loạiloài 15 Culex spp. được chọn ngẫu nhiên để nhập vào cơ sở dữ liệu của chúng tôi. BLAST cho thấy bốn mẫu giống với Cx. Tritaeniorhynchus từ 99,3% đến 100% (MF179219; MF179221; MF179231; MF179232), bốn mẫu giống với Cx. pseudovishnui từ 97,9% đến 98,2% (AB738092; LC054483), bốn mẫu giống với Cx. vishnui từ 99,2% đến 100% (MF179240), hai mẫugiống Cx. fuscocephala100% (HQ398887) và một mẫu giống 98% với Cx. pallidothorax (MF179281). Chỉ có một loài Cx. quinquefasciatus không thể định loại được bằng mã vạch DNA COI_1; loài này sau đó được định danh bằng gen Ace2,được chứng minh là có chung nhận dạng từ 99,6% đến 100% với GenBank (MN299021; MK575480) (Bảng 3).

Tương tự, đối với các mẫu vật có sự khác biệt giữa định danh hình thái và định danh MALDITOF MS, tức là An. aconitus được MALDI-TOF MSđịnh danh là An. varuna; An. dirus được định danh là An. sinensis; An. minimus là An. varuna; An. jamesi là An. maculatus;An. Pediteniatus là An. sinensis, và Culex sp. được định danh là An. minimus, An. jamesii, và An. dirus. Chúng tôi nhận thấy có sự định danh nhất quán giữa MALDI-TOF MS và các công cụ phân tử sau khi truy vấn trình tự dựa vào các cơ sở dữ liệu lưu trữ trên GenBank. Tuy nhiên, đối với một số mẫu vật đã được xác định hình thái là An. maculatus s.l., trình tự COI_1 giống với An. Maculatus 93,44% (KT382822). Chúng tôi không thu được trình tự gene cho các mẫu vật này với geneITS(gene ITS thường được sử dụng để phân biệt giữa các loài phức hợp An.maculatus) (Bảng 3).

Hình 3. Biểu đồ Dendrogram cho thấy quang phổ của loài muỗi được xác định
là Anopheles maculatus senus lato hình thành hai nhánh khác biệt

Cuối cùng, truy vấn trình tự các mẫu được chọn để xác nhận cho thấy sự phù hợp hoàn toàn giữa định danh bằng MALDI-TOF MS vàđịnh danh bằng sinh họcphân tử (Bảng 2 và 3).

Trình tự COI_1, COI_2 hoặc Ace2 của một số mẫu vật đã được giải mã và gửi lênGenBank, tên và số truy cập được liệt kê trong Tệp bổ sung 5: Bảng S3. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng các trình tự COI_1 và các tương đồng của chúng có sẵn trên GenBank, cho thấy 22 loài muỗi này hình thành các nhóm riêng biệt (Hình 4)dù tương quan với định danhvề hình thái và MALDI-TOF MS.

BÀN LUẬN

MALDI-TOF MS là một công cụ cải tiến để chuẩn đoán nhanh và chính xác các loàiđộng vật chân khớp [21]. Báo cáo đầu tiên, về các phổ tham chiếu MALDI-TOF MS được chiết xuất protein từ chân muỗi thu thập tại Việt Nam. Các loài này phân bố rộng rãi và có vai trò y học quan trọng, được bắt thường xuyên nhất trong các chương trình quản lý và giám sát côn trùng học ở khu vực miền Trung - Tây Nguyên Việt Nam. Trong số đó, An. minimus s.l., An. dirus s.l. và An. maculatus s.l. được nhận định là véc-tơ chính truyền bệnh sốt rét ở người tại Việt Nam [40–42] và các khu vực khác của Đông Nam Á, chẳng hạn như Lào, Campuchia và Thái Lan [28, 43, 44]. Aedes albopictus và Ae. aegypti, là véc-tơ truyền bệnh sốt xuất huyết. Các vụ dịch sốt xuất huyếtgần đây vàonăm 2017 và 2019 gây nên183.287 và 200.000 ca mắc, với 32 và 50 ca tử vong, lần lượt [45–47]. Hai loài Aedes này cũng là véc-tơ quan trọng của vi rút CHIKV và vi rút Zika, sự hiện diện của hai véc tơ nàytrở thànhgánh nặng bệnh tật do arbovirus gây nên ở Việt Nam [48]. Muỗi thuộc giống Culex là vật trung gian truyền bệnh JEV trên khắp Việt Nam [49]. Mặc dù đã có vắc xin viêm não Nhật Bản JEV từnăm 1997 và tiêm chủng bắt buộc cho trẻ em dưới 5 tuổi ở Việt Nam [49] trong 10 năm qua,nhưng số trường hợp mắc JEV trung bình hàng năm vẫn từ 1.000 đến 1.200, với 20 đến 50 trường hợp tử vong [ 50].

Bảng 3: Chi tiết về kết quả của các mẫu vật được gửi để phân tích sinh học phân tử và sự tương đồng với các trình tự tham chiếu có sẵn trênGenBank bằng cách sử dụng BLAST

^agen COI_1^bgen Ace2 ^cgenCOI_2

Trong nghiên cứu này, tất cả các loài muỗi được thu thập bằng bốn phương phápkhông thực sự có nhiều tác động đến chất lượng của hồ sơ dữ liệu MALDI-TOF MS, cho dù thời gian muỗi phơi nhiễm với nhiệt độ và độ ẩm thay đổi nhiều. Sau 12 giờ sử dụng bẫy màn gia súc, CDC-LT và bẫy BG-Sentinel, so sánh với phương pháp HLCs, các giá trị trung bình LSVs vẫn ở điểm ngưỡng tối ưu (tức là 1,7). Tính ổn định của kết quả MALDI-TOF MS có thể được giải thích là do muỗi được xử lý cẩn thận trước khi được bảo quản khô trong các tuýp chứa silica gel.

Hai loài Aedes và 14 loài Anopheles được xác định dựa trên các đặc điểm hình thái. Ngược lại, các mẫu Culex chỉ được xác định ở cấp độ giống dựa trên các đặc điểm hình thái,do tính nguyên vẹn của muỗi,không cho phép phân biệt giữa các loài đồng hinh và các nhóm loài khó hiểu. Mặc dù định loại hình thái là “tiêu chuẩn vàng” để phân biệt muỗi dựa trên các đặc điểm hình thể bên ngoài. Tuy nhiên, phương pháp này không thể phân biệt được các loài thuộc cùng phức hợp loài. Trong nghiên cứu này, hầu hết tất cả các loài Culex đã được địnhdanhđều thuộc các phức hợp loài, không chỉ khó phân biệt về mặt hình thái [51] mà còn cả về mặt sinh học phân tử [23, 39, 52].

84% mẫu muỗi được phân tích bằng MALDI-TOF MS cho các phổ MS chất lượng cao. Chất lượng của các quang phổ thu được từ Aedes spp. cao hơn so với các phổ MS thu được từ Anopheles spp. và Culex spp. Tuy nhiên, tỷ lệ phổ chất lượng tốt của chúng tôi là thấp hơn so với tỷ lệ được báo cáo trong một nghiên cứu về muỗi được bảo quản ở -20°C [53]. Điều này là do sự khác biệt trong phương pháp bảo quản, như đã được chứng minh bởi các nghiên cứu trước đây,nhấn mạnh rằng, bảo quản ở -20°C là phương pháp tốt nhất để bảo quản động vật chân khớpcho phân tích MALDI-TOF MS trong thời gian không quá 6 tháng [54] trong khi đối với các phân tích MALDI -TOF MS được thực hiện sau khoảng thời gian vượt quá 6 tháng bằng phương pháp bảo quản tốt nhất là tại - 80°C [39]. Tuy nhiên, nhiều phòng thí nghiệm không có tủ đông -80°C để bảo quản muỗi, và trong những trường hợp nàythì để đông lạnh -20°C là phương pháp tối ưu. Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện trong điều kiện thực địa, tỷ lệ phổ có chất lượng cao hơn so với một nghiên cứu khác trên muỗi cũng được bảo quản trong silica gel [20].

Phổ MS được tạo ra từ chân của các loài muỗi khác nhau và biểu đồ dendrogram cho thấy sự lặp lại của các loài trong cùng loàivà sự đặc trưng giữa các loài khác nhau hay nhóm các mẫu vật của cùng một loài trên cùng một nhánh (Hình 2; Tập tin bổ sung 2: Hình S1). Tính đặc trưng này của phổ MALDI-TOF MS của muỗi đã được báo cáo [20, 23, 53].

Phân tích MALDI-TOF MS cho phép chúng tôi xác định 22 loài muỗi, với điểm LSVs nằm trong khoảng từ 1,708 - 2,843, bao gồm 18 loài không có trong cơ sở dữ liệu MALDI-TOF MS. Hai loài Anopheles (An. Kochi và An. Jeyporiensis) được xác định dựa trên các đặc điểm hình thái và 11 mẫu Culex sp. không đượcMALDI-TOF MS định danh, vì các phổ của chúng không có trong cơ sở dữ liệu của chúng tôi. An. kochi và Culex không được xác định về mặt phân tử trong nghiên cứu, vì chúng tôi không thu được trình tự DNA từ chúng, mặc dù các khối phổ này đều có chất lượng tốt. Phổ động vật chân khớpchỉ được thêm vào cơ sở dữ liệu của chúng tôi khi mẫu vật được xác định rõ ràng bằng phân tích hình thái học và sinh học phân tử [17]. Chúng tôi chỉ có một mẫu vật của An. jeyporiensis mà phổ MS có chất lượng kém [cường độ thấp hơn: <3000 AU; không có tính lập lạicủa các phổ trong cùng loài và gây nhiễu). Ngoài việc có thể xác định được các loài muỗi có quan hệ họ hàng gần, chúng tôi thấy rằng MALDI-TOF MS có thể phân biệt được giữa các phân nhóm của các loài của cùng một phức hợp, mà không thể phân biệt về mặt hình thái, như trường hợp của phức hợp An. minimus (An. minimus và An. harrisoni trước đây được gọi là An. minimus A và C) [55, 56] và phức hợpAn. maculatus s.l. (Hình 2, 3). Điều thú vị là hai danh sách hàng đầu để phân loại loài là Cx. quinquefasciatus và Cx. pipiens, đều tương ứng trình tự từ 99 đến 100%. Các mẫuCx. quinquefasciatusnày sau đó được phân loại theo Ace_2 (Bảng 3). Các nghiên cứu sơ bộ đã báo cáo rằng kỹ thuật MALDI-TOF MS có khả năng xác định các loài động vật chân khớp ở cấp độ loài, phân nhóm loài hoặc cấp độ phức hợp [20, 57].

Việc định danh loài về hình thái học của tất cả các mẫu vật được đưa vào cơ sở dữ liệu của chúng tôi, đã được giám định bằng sinh học phân tử bằng ít nhất một loại gen. Chúng tôi nhận thấy, sự nhất quán giữa các đặc điểm định loại hình thái học và phân tử, vì các trình tự của chúng tôi có các đặc điểm nhận dạng từ 96,6 đến 100% với các điểm tương đồng trên GenBank. Đối với các mẫu vật cho có sự mâu thuẫn giữa định loại hình thái học và định loại MALDI-TOF MS. Phân tích sinh học phân tử đã giám định cho sự chính xác của định loại bằng MALDI-TOF MS. Vì thế cho nên đã xảy ra các lỗi định loại hình thái, cho thấy những hạn chế của phương pháp này. Những lỗi này đã được MALDI-TOF MS xác định phần nào, mà chúng tôi cho là đáng tin cậy để định loại các loài chân khớp. Giải trình tự, là kỹ thuật cuối cùng chúng tôi sử dụng để hoặc là giám định kết quảđịnh loại về hình thái học và MALDI-TOF MS hoặc là tách hai, không cho phép chúng tôi xác định 11 mẫu Culex mà chúng tôi không có định dang về hình thái học và MALDI-TOF MS của loài. Điều này cho thấy rằng,tất cả các kỹ thuật đều có những hạn chế và việc xác định sinh học phân tử đòi hỏi một trình tự bộ gen đáng tin cậy và cần phải xác định sự hiện diện các trình tự tương đồng của mẫu vậttrên GenBank [26]. Bất chấp những khó khăn và hạn chế của việc định dang bằng hình thái, nó vẫn là tiêu chuẩn vàng khi định danh một mẫu vật chưa biết, đặc biệt khi phương pháp sinh học phân tử không thể xác địnhdo không có trình tự của nó trên GenBank hoặc do thiếu trình tự.

KẾT LUẬN

Đây là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng MALDI-TOF MS đểđịnh loại các loài muỗi bắt được ngoài thực địa ở Việt Nam, nơi gánh nặng về bệnh tật do các véc-tơ truyền bệnh này rất cao. Nó khẳng định rằng việc định loạisai loài muỗi về mặt hình thái học có thể được ngăn ngừa bằng phương pháp MALDI-TOF MS, với điều kiện là phổ tham chiếu của loài muỗi đó có trong cơ sở dữ liệu MALDI-TOF MS. Nghiên cứu cho phép chúng tôi làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu MALDI-TOF MS nội bộ của mình bằng cách thêm phổ tham chiếu của các loài mới. MALDI-TOF MS là một công cụ giám sát côn trùng học đầy hứa hẹn có thể góp phần đáng kể vào việc kiểm soát các bệnh do muỗi truyền ở Việt Nam.

1.XiaH,WangY,AtoniE,ZhangB,YuanZ.Mosquito-associatedvirusesinChina.VirolSin.2018;33:5–20.

2.WorldHealthOrganization(WHO).Vector-bornediseases.2017.https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/vector-borne-diseases.Accessed06Jan2021.

3.NakazawaS,MarchandRP,QuangNT,CulletonR,ManhND,MaenoY. Anophelesdirusco-infectionwithhumanandmonkeymalariaparasitesin Vietnam.IntJParasitol.2009;39:1533–7.

4.VanLongB,AllenG,BraunyM,LinhLTK,PallerlaSR,HuyenTTT,etal. Molecularsurveillanceandtemporalmonitoringofmalariaparasitesin focalVietnameseprovinces.MalarJ.2020;19:458.https://doi.org/10.1186/s12936-020-03561-6.

5.WorldHealthOrganization(WHO).WorldMalariaReport2016.2016.https://www.who.int/publications/i/item/9789241511711. Accessed 11Apr2021.

6.World Health Organization (WHO). Malaria. 2021. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/malaria.Accessed18Jan2021.

7.MoncayoAC,FernandezZ,OrtizD,DialloM,SallA,HartmanS,etal. Dengueemergenceandadaptationtoperidomesticmosquitoes.EmergInfect Dis.2004;10:1790–6.

8.BradyOJ,GethingPW,BhattS,MessinaJP,BrownsteinJS,HoenAG,

etal.Refiningtheglobalspatiallimitsofdenguevirustransmissionbyevidence-basedconsensus.PLoSNeglTropDis.2012;6:e1760.

9.WorldHealthOrganization(WHO).Globalstrategyfordengueprevention and control, 2012–2020. https://www.who.int/denguecontrol/9789241504034/en/.Accessed16May2021.

10.VanDungN.ChecklistoftheknownspeciesofCulicidaefoundinViet- nam.HoiNghiKhoaHocToanQuocVeSinhThaivaTaiNguyenSinhVat Lan.2021,http://iebr.ac.vn/database/HNTQ6/504.pdf.Accessed18Jan2021.

11.TandinaF,DoumboO,YaroAS,TraoréSF,ParolaP,RobertV.Mosquitoes (Diptera: Culicidae) and mosquito-borne diseases in Mali, West Africa.Parasit Vectors.2018;11:467.

12.NadlerSA,DELeónGPP.Integratingmolecularandmorphological approaches for characterizing parasite cryptic species: implicationsforparasitology. Parasitology.2011;138:1688–709.

13.GreenCA,GassRF,MunstermannLE,BaimaiV.Population-genetic evidencefortwospeciesinAnophelesminimusinThailand.MedVetEntomol.1990;4:25–34.

14.LauriA,MarianiPO.Potentialsandlimitationsofmoleculardiagnosticmethodsinfoodsafety.GenesNutr.2009;4:1–12.

15.HebertPDN,CywinskaA,BallSL,DeWaardJR.BiologicalidentificationsthroughDNAbarcodes.ProcBiolSci.2003;270:313–21.

16.Vega-RúaA,PagèsN,FontaineA,NuccioC,HeryL,GoindinD,etal.ImprovementofmosquitoidentificationbyMALDI-TOFMSbiotyp- ingusingproteinsignaturesfromtwobodyparts.ParasitVectors.2018;11:574.

17.LarocheM,Jean-MichelBérengerJM,PascalDelaunayP,DidierRaoult D,ParolaP,etal.Medicalentomology:areemergingfieldofresearch tobetterunderstandvector-borneinfectiousdiseases.ClinInfectDis. 2017;65:S30-8.

18.SevestreJ,DiarraAZ,LarocheM,AlmerasL,ParolaP.Matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: an emerging toolforstudyingthevectorsofhumaninfectiousdiseases.FutureMicro-biol.2021;16:323–40.

19.YssoufA,SocolovschiC,FlaudropsC,SokhnaCS,RaoultD,ParolaP,etal.Matrix-assistedlaserdesorptionionization—timeofflightmass

spectrometry:anemergingtoolfortherapididentificationofmosquitovectors.PLoSONE.2013.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072380.

20.DiarraAZ,LarocheM,BergerF,ParolaP.UseofMALDI-TOFMSforthe identificationofchadmosquitoesandtheoriginoftheirbloodmeal.AmJTropMedHyg.2019;100:47–53.

21.YssoufA,AlmerasL,RaoultD,ParolaP.Emergingtoolsforidentificationof arthropodvectors.FutureMicrobiol.2016;11:549–66.

22.DiarraAZ,AlmerasL,LarocheM,DoumboO,RaoultD,ParolaP,etal.MolecularandMALDI-TOFidentificationofticksandtick-associatedbacteriainMali.PLoSNeglTropDis.2017;11:e0005762.

23.LawrenceAL,JanaBatovskaJ,WebbCE,ŠlapetaJ,ParolaP,LarocheM, etal.AccurateidentificationofAustralianmosquitoesusingprotein profiling. Parasitology.2019;146:462–71.

24.BenkacimiL,GazelleG,ElHamzaouiB,BérengerJM,ParolaP,LarocheM.MALDI-TOFMSidentificationofCimexlectulariusandCimexhemipterus bedbugs. Infect Genet Evol. 2020;85:104536. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2020.104536.

25.OuartiB,LarocheM,RighiS,MeguiniMN,BenakhlaA,RaoultD,etal.DevelopmentofMALDI-TOFmassspectrometryfortheidentificationof lice isolated from farm animals. Parasite. 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2020026.

26.FavrotC.Polymerasechainreaction:advantagesanddrawbacks.In:3. CongressoLatinoamericanodeDermatologiaVeterinaria[ThirdLatin AmericanCongressofVeterinaryDermatology],26–27Nov2015;Buenos Aires.https://www.zora.uzh.ch/id/eprint/116536.Accessed18Jan2021.

27.

==

NationalInstituteofMalariology,ParasitologyandEntomology(NIMPE) Vietnam.BangDinhLoaimuoiAnophelinaeoVietnam.2006.http://nimpe.vn/TinChiTiet.aspx?id33&cat4.Accessed21Dec2020.

28.RattanarithikulR,HarrisonBA,HarbachRE,PanthusiriP,ColemanRE. IllustratedkeystothemosquitoesofThailand.IV.Anopheles.Southeast AsianJTropMedPublicHealth.2006;37:1–128.

29.ReubenR,TewariSC,HiriyanJ,AkiyamaJ.Illustratedkeystospeciesof Culex(Culex)associatedwithJapaneseencephalitisinSoutheastAsia(Diptera:Culicidae).MosquitoSystematics.1994;26:75–96.

30.RuedaLM.Pictorialkeysfortheidentificationofmosquitoes(Dip- tera:Culicidae)associatedwithdenguevirustransmission.Zootaxa.2004;586:1–60.

31.FolmerO,BlackM,HoehW,LutzR,VrijenhoekR.DNAprimersforampli- ficationofmitochondrialcytochromecoxidasesubunitIfromdiversemetazoaninvertebrates.MolMarBiolBiotechnol.1994;3:294–9.

32.KambhampatiS.Aphylogenyofcockroachesandrelatedinsectsbased o­nDNAsequenceofmitochondrialribosomalRNAgenes.ProcNatlAcadSci USA.1995;92:017–20.

33.SmithJL,FonsecaDM.Rapidassaysforidentificationofmembersofthe Culex(Culex)pipienscomplex,theirhybrids,andothersiblingspecies(Diptera:culicidae).AmJTropMedHyg.2004;70:339–45.

34.CollinsFH,PaskewitzSM.AreviewoftheuseofribosomalDNA(rDNA) to differentiate among cryptic Anopheles species. Insect Mol Biol.1996;5:1–9.

35.KumarS,StecherG,TamuraK.MEGA7:molecularevolutionarygenetics analysisversion7.0forbiggerdatasets.MolBiolEvol.2016;33:1870–4.

36.NebbakA,WillcoxAC,BitamI,RaoultD,ParolaP,AlmerasL.Standardi- zation of sample homogenization for mosquito identification using aninnovativeproteomictoolbasedonproteinprofiling.Proteomics.2016;16:3148–60.

37.YssoufA,ParolaP,LindströmA,LiljaT,BerengerJM,RaoultD,etal.Iden- tificationofEuropeanmosquitospeciesbyMALDI-TOFMS.ParasitolRes.2014;113:2375–8.

38.NabetC,KoneAK,DiaAK,SyllaM,GautierM,YattaraM,etal.Newassess- mentofAnophelesvectorspeciesidentificationusingMALDI-TOFMS. Malar J.2021;20:33.

39.RakotonirinaA,PolM,KainiuM,BarsacE,TutagataJ,KilamaS,etal. MALDI-TOFMS:optimizationforfutureusesinentomologicalsurveil- lanceandidentificationofmosquitoesfromNewCaledonia.ParasitVectors.2020;13:359.

40.DoMC,BeebeNW,NguyenTVV,NguyenXT,LeNA,CooperRD,etal. Vectorsandmalariatransmissionindeforested,ruralcommunitiesin north-centralVietnam.MalarJ.2010;9:259.

41.GarrosC,VanNguyenC,TrungHD,BortelWV,CoosemansM,ManguinS. DistributionofAnophelesinVietnam,withparticularattentiontomalariavectorsoftheAnophelesminimuscomplex.MalarJ.2008;7:11.

42.NgoCT,DuboisG,SinouV,ParzyD,LeHQ,HarbachRE,ManguinS.Diver- sityofAnophelesmosquitoesinBinhPhuocandDakNongprovincesof Vietnamandtheirrelationtodisease.ParasitVectors.2014;7:316.

43.MarasriN,OvergaardHJ,SumarnroteA,ThanispongK,CorbelV,Chare- onviriyaphapT.AbundanceanddistributionofAnophelesmosquitoes inamalariaendemicareaalongtheThai–Laoborder.JVectorEcol. 2017;42:325–34.

44.Vantaux A, Samreth R, Piv E, Siv S, Taylor WR, Ménard D, et al. Contribution tomalariatransmissionofsymptomaticandasymptomaticparasitecarri- ersinCambodia.JInfectDis.2018;217:1561–8.

45.World Health Organization (WHO). Dengue situation update 533, 2 January 2018. 2018. https://reliefweb.int/report/viet-nam/dengue-situation-update-533-2-january-2018.Accessed17Jan2021.

46.QuyN.Denguefeveroutbreakkills50acrossVietnam.VnExpressInterna- tional. 31 Oct 2019. https://e.vnexpress.net/news/news/dengue-fever- outbreak-kills-50-across-vietnam-4005827.html.Accessed17Jan2021.

47.Dang TT, Pham HM, Bui VH, Le VD. Whole genome sequencing and genetic variations in several dengue virus type 1 strains from unusual dengue epidemic of 2017 in Vietnam. Virol J. 2020;17:7.

48.QuyenNTH,KienDTH,RabaaM,VanVinhChauN,WillsB,Simmons CP, et al. Chikungunya and zika virus cases detected against a backdrop of endemic dengue transmission in Vietnam. Am J Trop Med Hyg. 2017;97:146–50.

49.Nguyen TY, DuffyMR,NguyenMH,NguyenTH,FischerM,HillsSL.Surveil- lance for Japanese encephalitis in Vietnam, 1998–2007. Am J Trop Med Hyg. 2010;83:816–9.

50.Ngan D. Nangnong,canhgiaccaovoibenhviemnaoNhatBan.HQ Online. 2020. https://haiquanonline.com.vn/nang-nong-canh-giac-cao- voi-benh-viem-nao-nhat-ban-127028-127028.html. Accessed 17 Jan2021.

51.Shaikevich EV, Vinogradova EB, Bouattour A, de Almeida APG. Genetic diversityofCulexpipiensmosquitoesindistinctpopulationsfromEurope: contribution of Culex quinquefasciatus in Mediterranean populations. Parasit Vectors.2016;9:47.

52.BatovskaJ,BlacketMJ,BrownK,LynchSE.Molecularidentificationof mosquitoes(Diptera:Culicidae)insoutheasternAustralia.EcolEvol.2016;6:3001–11.

53.Tandina F, NiaréS,LarocheM,DoumboOK,Raoult D, Parola P, etal.Using MALDI-TOF MS to identify mosquitoes collected in Mali and their blood meals. Parasitology. 2018;145:1170–82.

54.NebbakA,ElHamzaouiB,BerengerJ-M,BitamI,Raoult D, AlmerasL,et al. Comparative analysis of storage conditions and homogenization meth- ods for tick and flea species for identification by MALDI-TOF MS. Med Vet Entomol. 2017;31:438–48.

55.HarbachRE,GarrosC,ManhCN,ManguinS.Formaltaxonomyofspecies CoftheAnophelesminimussiblingspeciescomplex(Diptera:Culicidae).Zootaxa.2007;1654:1.https://doi.org/10.11646/zootaxa.1654.1.3.

56.HarbachRE,ParkinE,ChenB,ButlinRK.Anopheles(Cellia)minimus theobald (Diptera: Culicidae): neotype designation, characterization, andsystematics.ProcEntomolSocWash.2006;108:198–209.

57.NiareS,TandinaF,DavousB,RaoultD,ParolaP,LionelAlmerasL,etal. AccurateidentificationofAnophelesgambiaeGilestrophicpreferencesby MALDI-TOFMS.InfectGenetEvol.2018;63:410–9.

Các nội dung khác »

---

• Phân tích nguyên nhân tử vong do sốt rét tại các vùng trọng điểm và giải pháp khắc phục ở tỉnh Đắc Lắc (05/07/2005)