Vien Sot ret Ky Sinh Trung - Con trung Quy Nhon

Cùng với ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc artemisinin thì vấn đề muỗi kháng hóa chất diệt côn trùng trên toàn cầu đang làm cho các nhà chuyên môn quan tâm và lo ngại. Theo WHO, kháng hóa chất diệt côn trùng là khả năng côn trùng sống sót sau khi tiếp xúc/phơi nhiễm với hóa chất diệt ở liều lượng mà trước đó côn trùng chết, những cá thể kháng hóa chất sống sót được tồn tại và phát triển bằng cách chọn lọc tự nhiên và đột biến.

Hiện nay, có hơn 500 loài côn trùng trên thế giới đã kháng với hóa chất diệt côn trùng, trong đó có hơn 50 loài muỗi sốt rét Anophelescó vai trò quan trọng trong chu trình lan truyền ký sinh trùng sốt rét cho con người. Kháng hóa chất diệt côn trùng đã được báo cáo ở các véc tơ sốt rét chính trên toàn thế giới. Tuy nhiên tình trạng muỗi kháng với hóa chất phân bố không đồng đều giữa các véc tơ và có thể khác nhau rất lớn giữa các làng, tỉnh, quốc gia, khu vực và châu lục trên phạm vi toàn cầu.

Song, có một vấn đề đáng báo động đó là muỗi kháng hóa chất diệt côn trùng mức cao nhất được báo cáo xảy ra ở châu Phi, nơi mà gánh nặng sốt rét vẫn cao nhất trên thế giới. Pyrethroid - một nhóm hóa chất diệt côn trùng được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong việc sử dụng cho màn tẩm hóa chất tồn lưu lâu dài (Long lasting insecticide treated nets-LLINs) và phun tồn lưu trong nhà (Indoor residual spraying-IRS). Chính việc sử dụng rộng rãi hóa chất diệt côn trùng đã làm cho quần thể muỗi sốt rét kháng và đe dọa những thành tựu đã đạt được trong việc kiểm soát bệnh sốt rét.

Hiện nay giám sát kháng hóa chất diệt côn trùng hầu hết phụ thuộc vào thử nghiệm sinh học, bằng cách sử dụng cố định các nồng độ hóa chất diệt côn trùng và thời gian tiếp xúc. Kết quả thử nghiệm sinh học được báo cáo bằng tỷ lệ phần trăm muỗi chết và hiệu quả muỗi ngã gục (Knock Down - KD). Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization_ WHO) đã xác định các liều lượng thử nghiệm (tức là liều gây chết 100% muỗi nhạy ở một loài nhất định sau khi tiếp xúc với hóa chất) cho hầu hết các loại hóa chất sử dụng trong phòng chống véc tơ sốt rét và sản xuất bộ dụng cụ để kiểm tra tính nhạy cảm của muỗi bao gồm dụng cụ tiếp xúc với hóa chất và giấy lọc tẩm với hóa chất diệt côn trùng.

Các bước thực hiện thử nghiệm đơn giản và kết quả thử nghiệm liều lượng sẽ cung cấp thông tin về kháng hóa chất tại các địa phương.

Hiện có ít nhất 3 phương pháp quan trọng để phát hiện các cơ chế kháng hóa chất diệt côn trùng trên thế giới gồm thử nghiệm sinh học (Bioassays), thử nghiệm sinh hóa (Biochemical bioassay) và thử nghiệm phân tử (Molecular test). Cần chú ý, không có phương pháp nào trong số các phương pháp hiện nay phù hợp cho việc phát hiện kháng biểu bì (kháng do giảm tính thẩm thấu) và kháng tập tính (behavioural resistance).

Thường xuyên theo dõi muỗi kháng hóa chất diệt côn trùng là điều cần thiết để có các phản ứng chủ động nhằm ngăn ngừa kháng hóa chất diệt côn trùng lan rộng và ảnh hưởng đến chương trình phòng chống véc tơ.

Phương pháp	Thuận lợi	Không thuận lợi
Thử nghiệm sinh học bằng cách sử dụng các liều lượng hóa chất diệt côn trùng chẩn đoán theo WHO.	Đạt tiêu chuẩn, dễ thực hiện và phát hiện tất cả các cơ chế kháng.	Thiếu nhạy cảm, không cung cấp thông tin về mức độ và cơ chế kháng hóa chất (ngoại trừ khi sử dụng các chất hỗ trợ), thực hiện trên muỗi sống
Thử nghiệm sinh học đáp ứng liều lượng.	Cung cấp dữ liệu đối với mức độ kháng hóa chất trong quần thể và không quan tâm đến cơ chế kháng.	Yêu cầu số lượng muỗi sống lớn và dữ liệu từ các nhóm khác nhau không dễ dàng so sánh.
Thử nghiệm hóa sinh để phát hiện các hoạt tính của men liên quan đến kháng hóa chất diệt côn trùng.	Cung cấp thông tin đối với các cơ chế kháng liên quan đến kháng hóa chất diệt côn trùng.	Yêu cầu mẫu giữ lạnh. Không thích hợp cho tất cả các cơ chế kháng, các vấn đề nhạy cảm và độ đặc hiệu cho một số thử nghiệm (ví dụ, GST)
Xét nghiệm phân tử phát hiện các alen kháng.	Rất nhạy. Có thể phát hiện các alen lặn và do đó cung cấp cảnh báo sớm về kháng hóa chất diệt côn trùng xảy ra trong tương lai.	Đòi hỏi chuyên môn và dụng cụ đắt tiền. Chỉ giới hạn ở một số cơ chế kháng hóa chất

Phát hiện khác bằng phương pháp Bioassay

Hướng dẫn các bước thực hiện thử nghiệm và diễn giải kết quả thử nghiệm được miêu tả trong tài liệu của WHOPES3 (truy cập http://www.who.int/whopes/resistance/eng/). Điều quan trọng là những cá thể muỗi được sử dụng trong thử nghiệm sinh học phải đạt tiêu chuẩn về độ tuổi, giới và trạng thái sinh lý vì tất cả các yếu tố này có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Các cá thể trưởng thành có đặc trưng là phát triển từ những cá thể muỗi cái giống nhau hoặc từ thế hệ F1 được sử dụng để kiểm tra tính kháng hóa chất. Thử nghiệm ở các liều lượng được thực hiện đơn giản và cung cấp các bộ dữ liệu chuẩn hóa, giả định các nguyên tắc thử nghiệm được tuân thủ, điều này có thể dễ dàng so sánh để xác định thời gian và / hoặc sự thay đổi địa lý tình trạng kháng hóa chất của các quần thể véc tơ sốt rét.

Tuy nhiên, quan trọng là nhận ra một số hạn chế của phương pháp thử nghiệm tính nhạy cảm này. Duy nhất một nồng độ hóa chất diệt côn trùng được sử dụng, kết quả không cung cấp bất kỳ thông tin nào về mức độ kháng hóa chất của quần thể muỗi. Ví dụ, nếu 50% quần thể A và 20% quần thể B được giết chết sau khi tiếp xúc với nồng độ permethrin thử nghiệm thì không thể kết luận quần thể B kháng hóa chất hơn quần thể A.

Kết quả này chỉ nói lên rằng cả hai quần thể đều kháng hóa chất (theo tiêu chuẩn của WHO nếu tỷ lệ muỗi chết dưới 80% thì xác định quần thể muỗi đã kháng với hóa chất diệt côn trùng) và tùy thuộc vào ý nghĩa các thử nghiệm, tầng suất kháng ở các cá thể trong quần thể B cao hơn quần thể A. Các thử nghiệm đáp ứng liều lượng là cần thiết để so sánh các mức độ kháng hóa chất diệt côn trùng ở hai quần thể (ví dụ, đo lường tỷ lệ kháng và khoảng tin cậy 95%). Đối với các hóa chất nhóm pyrethroid, thời gian ngã gục trung bình cũng là một biến định lượng hữu ích. Tương tự như vậy, các kết quả thử nghiệm này không thể được sử dụng để so sánh các mức độ kháng đối với hai loại hóa chất diệt côn trùng khác nhau. Nếu tỷ lệ muỗi chết là 50% sau khi tiếp xúc với nồng độ hóa chất thử nghiệm permethrin (0.75%), trong khi đó nếu tỷ lệ chết 70% sau khi tiếp xúc với hóa chất deltamethrin ở liều lượng thử nghiệm (0.05%) thì không thể kết luận quần thể muỗi kháng với permethrin cao hơn so với deltamethrin. Một lần nữa, tất cả những gì có thể kết luận đó là quần thể muỗi đã kháng với cả hai loại hóa chất diệt côn trùng.

Một phần là do giới hạn của liều lượng thử nghiệm được miêu tả như trên và một phần do khó khăn mà đôi khi phát sinh trong việc có được một nguồn cung cấp giấy thử tẩm hóa chất thường xuyền từ WHO, một phương pháp thử nghiệm sinh học thay thế đã được phát triển và đang được chấp nhận ở một số chương trình giám sát. Phương pháp này được gọi là thử nghiệm sinh học bằng chai CDC (CDC bottle bioassay), sử dụng chai thủy tinh chứa đựng một nồng độ hóa chất diệt côn trùng biết trước. Những bộ dụng cụ thử nghiệm được lắp ráp bởi những người thực hiện trong phòng thí nghiệm, nồng độ hóa chất diệt côn trùng có thể dễ dàng điều chỉnh cho phép liều lượng đáp ứng để so sánh hai hay nhiều chủng khác nhau. Lời cảnh báo cho điều này đó là sự linh hoạt và khả năng thay đổi ở các lớp hóa chất diệt côn trùng được sử dụng trong các thử nghiệm, làm suy yếu kết quả so sánh giữa hai nghiên cứu riêng biệt.

Thử nghiệm chai CDC và thử nghiệm các liều lượng chẩn đoán của WHO cả hai có thể được thay đổi để các chất hỗ trợ kết hợp chặc chẽ. Các chất hỗ trợ như piperonyl butoxide ngăn chặn hoạt động của hai họ men giải độc tố chính, có thể được sử dụng để khám phá vai trò các cơ chế kháng khác nhau. Nếu kháng hóa chất là do gia tăng chuyển hóa thì tiếp xúc với một chất hỗ trợ thích hợp trước khi thử nghiệm với hóa chất diệt côn trùng sẽ làm gia tăng mức độ chết của côn trùng.

Phát hiện kháng hóa chất bằng phương pháp thử nghiệm CDC chai (CDC bottle bioassay)

Thử nghiệm hóa sinh nhằm mục đích phát hiện các hoạt động biến đổi của các loại men liên quan đến kháng hóa chất diệt côn trùng có sẵn trong hơn hai thập kỷ qua và thỉnh thoảng được sử dụng kết hợp với phương pháp thử nghiệm sinh học hóa chất diệt côn trùng. Những thử nghiệm này sử dụng kiểu chất nền để ghi nhận toàn bộ hoạt động của các men glutathione transferases, carboxylesterases hoặc cytochrome P450s ở từng cá thể côn trùng riêng biệt. Thử nghiệm hóa sinh cũng có sẵn để phát hiện kháng vị trí đích đối với hóa chất thuộc nhóm phosphat hữu cơ, carbamate nguyên nhân là không nhạy acetylcholinesterase. Các phản ứng enzyme tạo ra sự thay đổi màu sắc điều này có thể nhìn thấy bằng mắt thường và do vậy các thử nghiệm này không yêu cầu tiếp cận các thiết bị đắc tiền (quang phổ thích hợp). Tuy nhiên, điều quan trọng là những cá thể muỗi khi thu thập phải được bảo quản lạnh từ những điểm thu thập để thực hiện thử nghiệm và điều này có thể thường gây ra những thách thức liên quan đến công tác hậu cần bảo quản mẫu. Hơn nữa, có các vấn đề về nhạy cảm và độ đặc hiệuđiều này hạn chế những tiện ích của một số thử nghiệm này. Ví dụ, có hơn 100 enzym cytochrome P450 khác nhau ở các vec tơ sốt rét, một thử nghiệm đo lường toàn bộ mức độ hoặc hoạt tính của họ enzyme này không thể có, sự nhạy cảm để phát hiện đối với một enzyme duy nhất hoặc một lượng nhỏ các enzyme P450 được cho là tham gia vào sự trao đổi chất pyrethroid. Điều này có thể giải thích thiếumối tương quan đáng kể được quan sát thấy trong nhiều nghiên cứu giữa hoạt động cytochrome P450 và kết quả muỗi chết khi thử nghiệm sinh học. Ngoài ra không phải tất cả enzyme sẽ có cầu trúc giống nhau cho các chất bỗ trợ được sử dụng trong các thử nghiệm này (ví dụ. CDNB - 1-chloro 2-4, dinitrobenzene) là những chất bỗ trợ tiêu biểu được sử dụng để đánh giá hoạt tính của glutathione transferase những lớp Epsilon của GSTs mà chịu trách nhiệm cho kháng DDT có hoạt động tương đối thấp với chất bỗ trợ này). Để mà kết hợp chặc chẽ số liệu từ giám sát kháng dựa vào bằng chứng để đưa ra các quyết định can thiệp kiểm soát véc tơ dựa vào hóa chất diệt côn trùng, điều đó rất cần thiết trong kế hoạch kiểm soát véc tơ truyền bệnh. Mặc dù các hướng dẫn để tiến hành các thử nghiệm có sẵn là khác nhau, có rất ít sự đồng ý về số lượng các điểm và tần suất giám sát kháng hóa chất nên xảy ra. Rõ ràng kháng hóa chất là một đặc tính không ngừng thay đổi và có sự biến động lớn ở các mức độ kháng thông qua lan truyền sốt rét theo mùa đã được báo cáo. Khánghóa chất cũng có thể rất trọng tâm, đặc biệt là khi thành phần véc tơ khác nhau giữa các điểm, do đó một số lượng điểm lấy mẫu tối thiểu phải được thành lập, tham gia vào được coi là các mẫu phân bố véc tơ và sử dựng hóa chất diệt côn trùng.

Mạng lưới kiểm soát véc tơ kháng hóa chất châu Phi WHO/AFRO được thành lập vào năm 2000 với nhiều mục tiêu quan trọng, trong đó mục tiêu quan trọng nhất là cải thiện số liệu kháng hóa chấtđược công bố. Vì vậy, một cơ sở dữ liệu được thành lập để lưu trữ tất cả các kết quả của các hoạt động giám sát kháng hóa chất của các véc tơ sốt rét do các thành viên của Mạng lưới kháng hóa chất ở châu Phi (ANVR) thực hiện, nhưng cho đến nay, cơ sở dữ liệu này không phải dễ dàng để người ngoài truy cập vào. Việc thành lập cơ sở dữ liệu mới gần đây được xem như là một nguồn dữ liệu tập trung trực tuyến cho việc thu thập các dữ liệu về kháng hóa chất ở các véc tơ truyền bệnh và kết hợp dữ liệu này vào cơ sở dữ liệu của ANVR, hi vọng sẽ đảm bảo rằng cả dữ liệu kháng đã công bố và chưa công bố ở các véc tơ sốt rét là có sẵn để cho tất cả các những cá nhân, tố chức quan tâm tiếp cận.

Nhiều thử nghiệm phân tử đã được phát triển để phát hiện các alen kdr ở các loài muỗi sốt rét, một trong số các phương pháp đó gần đây đã được so sánh trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Bass và cộng sự (2007). Những phương pháp này thường xuyên được sử dụngbởinghiên cứu giám sát phòng thí nghiệm đối với kháng hóa chất diệt côn trùng và đang dần được tích hợp vào một số chương trình giám sát kháng hóa chất trong phòng chống sốt rét quốc gia. Tuy nhiên, mặc dù gần đây đã xác định được các enzym chính liên quan đến kháng do chuyển hóa pyrethroid ở loài muỗi An gambiae và An funestus, hiện tại không có thử nghiêm dựa vào DNA sơi đơn để phát hiện các cơ chế đề kháng này. Phát hiện các gen này hiện nay phụ thuộc vào các phương pháp dựa trên ARN sử dụng thiết bị tương đối phức tạp (ví dụ như RTqPCR).

Thử nghiệm để phát hiện các đột biến di truyền liên quan đến kháng kiểu hình ở những cá thể côn trùng có thể cung cấp một cảnh báo sớm về sự xuất hiện kháng hóa chất mà có thể không được phát hiện bằng phương pháp thử nghiệm sinh học vì phương pháp thử nghiệm sinh học chỉ có thể ghi lại các phản ứng của quần thể côn trùng.

Sự có mặt của một alen ở từng cá thể để bàn luận kháng hóa chất nên đây là lý do để tập trung, vì vậy kinh nghiệm đã chỉ ra rằng kháng hóa chất có thể lan rất nhanh trong quần thể trừ khi áp lực chọn lọc được giảm xuống hoặc hoặc giảm di truyền liên quan với alen kháng cao. Ngược lại, một kết quả âm tính từ các thử nghiệm phân tử không nên dẫn đến sự tự mãn.

Như đã thảo luận ở trên, hiện nay thử nghiệm phân tử chỉ thích hợp đối với kháng do thay đổi vị trí đích và thất bại trong việc phát hiện kdr rõ ràng không thể diễn giải như là một sự vắng mặt của kháng hóa chất trong quần thể. Do đó xét nghiệm phân tử nên được xem như một sự bổ sung chứ không phải là một phương pháp thay thế cho phương pháp thử nghiệm sinh học.

1.Ffrench-Constant RH: The molecular and population genetics of cyclodiene insecticide resistance. Insect Biochem Mol Biol 1994, 24(4):335-345.

2.Andreasen MH, Ffrench-Constant RH: In situ hybridization to the Rdl locus on polytene chromosome 3L of Anopheles stephensi. Med Vet Entomol 2002, 16(4):452-455.

3.Du W, Awolola TS, Howell P, Koekemoer LL, Brooke BD, Benedict MQ, Coetzee M, heng L: Independent mutations in the Rdl locus confer dieldrin resistance to Anopheles gambiae and An. arabiensis. Insect Mol Biol 2005, 14(2):179-183.

4.Davies TG, Field LM, Usherwood PN, Williamson MS: DDT, pyrethrins, pyrethroids and insect sodium channels. IUBMB Life 2007, 59(3):151-162.

5.Donnelly MJ, Corbel V, Weetman D, Wilding CS, Williamson MS, Black WCt: Does kdr genotype predict insecticide-resistance phenotype in mosquitoes? Trends Parasitol 2009, 25(5):213-219.

6.Martinez Torres D, Chandre F, Williamson MS, Darriet F, Berge JB, Devonshire AL, Guillet P, Pasteur N, Pauron D: Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Molecular Biology 1998, 7(2):179-184.

7.Ranson H, Jensen B, Vulule JM, Wang X, Hemingway J, Collins FH: Identification of a point mutation in the voltage-gated sodium channel gene of Kenyan Anopheles gambiae associated with resistance to DDT and pyrethroids. Insect Molecular Biology 2000, 9(5):491-497.

8.O'Reilly AO, Khambay BP, Williamson MS, Field LM, Wallace BA, Davies TG: Modelling insecticide-binding sites in the voltage-gated sodium channel. Biochem J 2006, 396(2):255-263.

9.Jones CM, Liyanapathirana M, Agossa FR, Weetman D, Ranson H, Donnelly MJ, Wilding CS: Footprints of positive selection associated with a mutation (N1575Y) in the voltage-gated sodium channel of Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A 2012, 109(17):6614-6619.

10.[11] Plapp FW, Jr.: The genetic basis of insecticide resistance in the house fly: evidence that a single locus plays a major role in metabolic resistance to insecticides. Pesticide Biochemistry and Physiology 1984, 22(2):194-201.

11.[12] Georghiou GP, Ariaratnam V, Pasternak ME, Lin CS: Organophosphorus multiresistance in Culex pipiens quinquefasciatus in California. Journal of Economic Entomology 1975, 68(4):461-467.

12.[13] Vontas J, David JP, Nikou D, Hemingway J, Christophides GK, Louis C, Ranson H: Transcriptional analysis of insecticide resistance in Anopheles stephensi using crossspecies microarray hybridization. Insect Mol Biol 2007, 16(3):315-324.

13.[14] Awolola TS, Oduola OA, Strode C, Koekemoer LL, Brooke B, Ranson H: Evidence of multiple pyrethroid resistance mechanisms in the malaria vector Anopheles gambiae sensu stricto from Nigeria. Trans R Soc Trop Med Hyg 2009, 103(11):1139-1145.

14.[15] Wood O, Hanrahan S, Coetzee M, Koekemoer L, Brooke B: Cuticle thickening associated with pyrethroid resistance in the major malaria vector Anopheles funestus. Parasit Vectors 2010, 3:67.

15.[16] Roberts DR, Chareonviriyaphap T, Harlan HH, Hshieh P: Methods of testing and analyzing excito-repellency responses of malaria vectors to insecticides. J Am Mosq Control Assoc 1997, 13(1):13-17.

16.[17] Chandre F, Darriet F, Duchon S, Finot L, Manguin S, Carnevale P, Guillet P: Modifications of pyrethroid effects associated with kdr mutation in Anopheles gambiae. Medical and Veterinary Entomology 2000, 14(1):81-88.

17.[18] Gahan JB, Lindquist AW: DDT residual sprays applied in buildings to control Anopheles quadrimaculatus. Journal of Economic Entomology 1945, 38 (2):223-230.

18.[19] Chareonviriyaphap T, Roberts DR, Andre RG, Harlan HJ, Manguin S, Bangs MJ: Pesticide avoidance behavior in Anopheles albimanus, a malaria vector in the Americas. J Am Mosq Control Assoc 1997, 13(2):171-183.

19.[20] Garros C, Marchand RP, Quang NT, Hai NS, Manguin S: First record of Anopheles minimus C and significant decrease of An. minimus A in central Vietnam. J Am Mosq Control Assoc 2005, 21(2):139-143.

20.[21] Russell TL, Govella NJ, Azizi S, Drakeley CJ, Kachur SP, Killeen GF: Increased proportions of outdoor feeding among residual malaria vector populations following increased use of insecticide-treated nets in rural Tanzania. Malar J 2011, 10:80.

21.[22] Moiroux N, Gomez MB, Pennetier C, Elanga E, Djenontin A, Chandre F, Djegbe I, Guis H, Corbel V: Changes in Anopheles funestus Biting Behavior Following Universal Coverage of Long-Lasting Insecticidal Nets in Benin. J Infect Dis 2012, 206(10): 1622-1629.

22.[23] WHO: Guidelines for testing mosquito adulticides intended for Indoor Residual Spraying (IRS) and Insecticide Treated Nets (ITNs). 2006, WHO/CDS/NTD/WHOPES/GCDDP/2006.3.

23.[24] WHO: Report of the WHO Informal Consultation Tests procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vectors, bio-efficacy and persistence of insecticides on treated surfaces. In. Geneva: World Health Organization: Parasitic Diseases and Vector Control (PVC)/Communicable Disease Control, Prevention and Eradication (CPE); 1998: 43.

24.[25] Williams J, Pinto J: Training Manual on Malaria Entomology; For Entomology and Vector Control Technicians (Basic Level) In. Edited by USAID. Washington, D.C.; 2012: 78.

25.[26] Ranson H, Abdallah H, Badolo A, Guelbeogo WM, Kerah-Hinzoumbe C, Yangalbe-Kalnone E, Sagnon N, Simard F, Coetzee M: Insecticide resistance in Anopheles gambiae: data from the first year of a multi-country study highlight the extent of the problem. Malar J 2009, 8(1):299.

26.[27] Skovmand O, Bonnet J, Pigeon O, Corbel V: Median knock-down time as a new method for evaluating insecticide-treated textiles for mosquito control. Malar J 2008, 7:114.

27.[28] Brogdon WG, McAllister JC: Simplification of adult mosquito bioassays through use of time-mortality determinations in glass bottles. J Am Mosq Control Assoc 1998, 14(2): 159-164.

28.[29] World Health Organization: Techniques to detect insecticide resistance mechanisms (field and laboratory manual). In. Edited by WHO/CDS/CPC/MAL/98.6 WHO. Geneva: World Health Organization; 1998.

29.[30] Munhenga G, Masendu HT, Brooke BD, Hunt RH, Koekemoer LK: Pyrethroid resistance in the major malaria vector Anopheles arabiensis from Gwave, a malaria-endemic area in Zimbabwe. Malar J 2008, 7:247.

30.[31] Okoye PN, Brooke BD, Koekemoer LL, Hunt RH, Coetzee M: Characterisation of DDT, pyrethroid and carbamate resistance in Anopheles funestus from Obuasi, Ghana. Trans R Soc Trop Med Hyg 2008, 102(6):591-598.

31.[32] Kelly-Hope L, Ranson H, Hemingway J: Lessons from the past: managing insecticide resistance in malaria control and eradication programmes. Lancet Infect Dis 2008.

32.[33] Chouaibou M, Etang J, Brevault T, Nwane P, Hinzoumbe CK, Mimpfoundi R, Simard F: Dynamics of insecticide resistance in the malaria vector Anopheles gambiae s.l. from an area of extensive cotton cultivation in Northern Cameroon. Trop Med Int Health 2008, 13(4):476-486.

33.[34] Djegbe I, Boussari O, Sidick A, Martin T, Ranson H, Chandre F, Akogbeto M, Corbel V: Dynamics of insecticide resistance in malaria vectors in Benin: first evidence of the presence of L1014S kdr mutation in Anopheles gambiae from West Africa. Malaria Journal 2011, 10(1):261.

34.[35] Dabire KR, Diabate A, Pare-Toe L, Rouamba J, Ouari A, Fontenille D, Baldet T: Year to year and seasonal variations in vector bionomics and malaria transmission in a humid savannah village in west Burkina Faso. J Vector Ecol 2008, 33(1):70-75.

35.[36] Bass C, Nikou D, Donnelly MJ, Williamson MS, Ranson H, Ball A, Vontas J, Field LM: Detection of knockdown resistance (kdr) mutations in Anopheles gambiae: a comparison of two new high-throughput assays with existing methods. Malar J 2007, 6:111.

36.[37] Corbel V, N'Guessan R, Brengues C, Chandre F, Djogbenou L, Martin T, Akogbeto M, Hougard JM, Rowland M: Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta Trop 2007, 101(3): 207-216.

37.[38] Diabate A: The Role of Agricultural Uses of Insecticides in Resistance to Pyrethroids in Anopheles gambiae S.L. in Burkina Faso. Am J Trop Med Hyg 2002, 67(6):617-622.

38.[39] Carnevale P, Toto JC, Guibert P, Keita M, Manguin S: Entomological survey and report of a knockdown resistance mutation in the malaria vector Anopheles gambiae from the Republic of Guinea. Trans R Soc Trop Med Hyg, 104(7):484-489.

39.[40] Yawson AE, McCall PJ, Wilson MD, Donnelly MJ: Species abundance and insecticide resistance of Anopheles gambiae in selected areas of Ghana and Burkina Faso. Med Vet Entomol 2004, 18(4):372-377.

40.[41] C. Fanello VP, A. della Torre, F. Santolamazza, G. Dolo, M. Coulibaly, A. Alloueche, C. F. Curtis, Y. T. Touré and M. Coluzzi: The pyrethroid knock-down resistance gene in the Anopheles gambiae complex in Mali and further indication of incipient speciation within An. gambiae s.s. Insect Molecular Biology 2003, 12(3):241-245.

41.[42] Czeher C, Labbo R, Arzika I, Duchemin J-B: Evidence of increasing Leu-Phe knockdown resistance mutation in Anopheles gambiae from Niger following a nationwide long-lasting insecticide-treated nets implementation. Malaria Journal 2008, 7(1):189.

42.[43] Awolola TS, Brooke BD, Hunt RH, Coetze M: Resistance of the malaria vector Anopheles gambiae s.s. to pyrethroid insecticides, in south-western Nigeria. Annals of Tropical Medicine and Parasitology 2002, 96(8):849-852.

43.[44] Koffi AA, Alou LP, Adja MA, Kone M, Chandre F, N'Guessan R: Update on resistance status of Anopheles gambiae s.s. to conventional insecticides at a previous WHOPES field site, "Yaokoffikro", 6 years after the political crisis in Cote d'Ivoire. Parasit Vectors 2012, 5:68.

44.[45] Dabire KR, Diabate A, Agostinho F, Alves F, Manga L, Faye O, Baldet T: Distribution of the members of Anopheles gambiae and pyrethroid knock-down resistance gene (kdr) in Guinea-Bissau, West Africa. Bull Soc Pathol Exot 2008, 101(2):119-123.

45.[46] Etang J, Fondjo E, Chandre F, Morlais I, Brengues C, Nwane P, Chouaibou M, Ndjemai H, Simard F: First report of knockdown mutations in the malaria vector Anopheles gambiae from Cameroon. Am J Trop Med Hyg 2006, 74(5):795-797.

46.[47] Ndjemai HN, Patchoke S, Atangana J, Etang J, Simard F, Bilong CF, Reimer L, Cornel A, Lanzaro GC, Fondjo E: The distribution of insecticide resistance in Anopheles gambiae s.l. populations from Cameroon: an update. Trans R Soc Trop Med Hyg 2009.

47.[48] Nwane P, Etang J, Chouaibou M, Toto JC, Kerah-Hinzoumbe C, Mimpfoundi R, Awono-Ambene HP, Simard F: Trends in DDT and pyrethroid resistance in Anopheles gambiae s.s. populations from urban and agro-industrial settings in southern Cameroon. BMC Infect Dis 2009, 9:163.

48.[49] Kerah-Hinzoumbe C, Peka M, Nwane P, Donan-Gouni I, Etang J, Same-Ekobo A, Simard F: Insecticide resistance in Anopheles gambiae from south-western Chad, Central Africa. Malar J 2008, 7:192.

49.[50] Janeira F, Vicente JL, Kanganje Y, Moreno M, Do Rosario VE, Cravo P, Pinto J: A primer-introduced restriction analysis-polymerase chain reaction method to detect knockdown resistance mutations in Anopheles gambiae. J Med Entomol 2008, 45(2): 237-241.

50.[51] Mourou JR, Coffinet T, Jarjaval F, Pradines B, Amalvict R, Rogier C, Kombila M, Pages F: Malaria transmission and insecticide resistance of Anopheles gambiae in Libreville and Port-Gentil, Gabon. Malar J 2010, 9:321.

51.[52] Himeidan YE, Chen H, Chandre F, Donnelly MJ, Yan G: Short report: permethrin and DDT resistance in the malaria vector Anopheles arabiensis from eastern Sudan. Am J Trop Med Hyg 2007, 77(6):1066-1068.

52.[53] Abdalla H, Matambo TS, Koekemoer LL, Mnzava AP, Hunt RH, Coetzee M: Insecticide susceptibility and vector status of natural populations of Anopheles arabiensis from Sudan. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2008, 102(3):263-271.

53.[54] Costantini C, Ayala D, Guelbeogo WM, Pombi M, Some CY, Bassole IH, Ose K, Fotsing JM, Sagnon N, Fontenille D et al: Living at the edge: biogeographic patterns of habitat segregation conform to speciation by niche expansion in Anopheles gambiae. BMC Ecol 2009, 9(1):16.

54.[55] Kulkarni MA, Malima R, Mosha FW, Msangi S, Mrema E, Kabula B, Lawrence B, Kinung'hi S, Swilla J, Kisinza W et al: Efficacy of pyrethroid-treated nets against malaria vectors and nuisance-biting mosquitoes in Tanzania in areas with long-term insecticide-treated net use. Trop Med Int Health 2007, 12(9):1061-1073.

55.[56] Kabula B, Tungu P, Matowo J, Kitau J, Mweya C, Emidi B, Masue D, Sindato C, Malima R, Minja J et al: Susceptibility status of malaria vectors to insecticides commonly used for malaria control in Tanzania. Trop Med Int Health 2012, 17(6):742-750.

56.[57] Coleman M, Casimiro S, Hemingway J, Sharp B: Operational impact of DDT reintroduction for malaria control on Anopheles arabiensis in Mozambique. J Med Entomol 2008, 45(5):885-890.

57.[58] Ratovonjato J, Le Goff G, Rajaonarivelo E, Rakotondraibe EM, Robert V: [Recent observations on the sensitivity to pyrethroids and DDT of Anopheles arabiensis and Anopheles funestus in the central Highlands of Madagascar; preliminary results on the absence of the kdr mutation in An. arabiensis]. Arch Inst Pasteur Madagascar 2003, 69(1-2):63-69.

58.[59] Ramphul U, Boase T, Bass C, Okedi LM, Donnelly MJ, Muller P: Insecticide resistance and its association with target-site mutations in natural populations of Anopheles gambiae from eastern Uganda. Trans R Soc Trop Med Hyg 2009.

59.[60] Verhaeghen K, Bortel WV, Roelants P, Okello PE, Talisuna A, Coosemans M: Spatiotemporal patterns in kdr frequency in permethrin and DDT resistant Anopheles gambiae s.s. from Uganda. Am J Trop Med Hyg 2010, 82(4):566-573.

60.[61] Abate A, Hadis M: Susceptibility of Anopheles gambiae s.l. to DDT, malathion, permethrin and deltamethrin in Ethiopia. Trop Med Int Health 2011, 16(4):486-491.

61.[62] Ochomo E, Bayoh MN, Brogdon WG, Gimnig JE, Ouma C, Vulule JM, Walker ED: Pyrethroid resistance in Anopheles gambiae s.s. and Anopheles arabiensis in western Kenya: phenotypic, metabolic and target site characterizations of three populations. Med Vet Entomol 2012.

62.[63] Mathias DK, Ochomo E, Atieli F, Ombok M, Bayoh MN, Olang G, Muhia D, Kamau L, Vulule JM, Hamel MJ et al: Spatial and temporal variation in the kdr allele L1014S in Anopheles gambiae s.s. and phenotypic variability in susceptibility to insecticides in Western Kenya. Malar J 2011, 10:10.

63.[64] Chanda E, Hemingway J, Kleinschmidt I, Rehman AM, Ramdeen V, Phiri FN, Coetzer S, Mthembu D, Shinondo CJ, Chizema-Kawesha E et al: Insecticide resistance and the future of malaria control in Zambia. PLoS onE 2011, 6(9):e24336.

64.[65] Mouatcho JC, Munhenga G, Hargreaves K, Brooke BD, Coetzee M, Koekemoer LL: Pyrethroid resistance in a major African malaria vector Anopheles arabiensis from Mamfene, northern KwaZulu-Natal, South Africa. South African Journal of Science 2009, 105(3-4):127-131.

65.[66] Mouatcho JC, Hargreaves K, Koekemoer LL, Brooke BD, Oliver SV, Hunt RH, Coetzee M: Indoor collections of the Anopheles funestus group (Diptera: Culicidae) in sprayed houses in northern KwaZulu-Natal, South Africa. Malar J 2007, 6:30.

66.[67] Brooke BD, Kloke G, Hunt RH, Koekemoer LL, Temu EA, Taylor ME, Small G, Hemingway J, Coetzee M: Bioassay and biochemical analyses of insecticide resistance in southern African Anopheles funestus (Diptera: Culicidae). Bulletin of Entomological Research 2001, 91(4):265-272.

67.[68] Cuamba N, Morgan JC, Irving H, Steven A, Wondji CS: High level of pyrethroid resistance in an Anopheles funestus population of the Chokwe District in Mozambique. PLoS onE 2010, 5(6):e11010.

68.[69] Kloke RG, Nhamahanga E, Hunt RH, Coetzee M: Vectorial status and insecticide resistance of Anopheles funestus from a sugar estate in southern Mozambique. Parasit Vectors 2011, 4:16.

69.[70] Hunt R, Edwardes M, Coetzee M: Pyrethroid resistance in southern African Anopheles funestus extends to Likoma Island in Lake Malawi. Parasit Vectors 2010, 3:122.

70.[71] Wondji CS, Coleman M, Kleinschmidt I, Mzilahowa T, Irving H, Ndula M, Rehman A, Morgan J, Barnes KG, Hemingway J: Impact of pyrethroid resistance on operational malaria control in Malawi. Proc Natl Acad Sci U S A 2012, 109(47):19063-19070.

71.[72] Anto F, Asoala V, Anyorigiya T, Oduro A, Adjuik M, Owusu-Agyei S, Dery D, Bimi L, Hodgson A: Insecticide resistance profiles for malaria vectors in the Kassena-Nankana district of Ghana. Malaria Journal 2009, 8(1):81.

72.[73] Djouaka R, Irving H, Tukur Z, Wondji CS: Exploring mechanisms of multiple insecticide resistance in a population of the malaria vector Anopheles funestus in Benin. PloS onE 2011, 6(11):e27760.

73.[74] Dabire KR, Baldet T, Diabate A, Dia I, Costantini C, Cohuet A, Guiguemde TR, Fontenille D: Anopheles funestus (Diptera: Culicidae) in a humid savannah area of western Burkina Faso: bionomics, insecticide resistance status, and role in malaria transmission. J Med Entomol 2007, 44(6):990-997.

74.[75] Faraj C, Adlaoui E, Brengues C, Fontenille D, Lyagoubi M: [Resistance of Anopheles labranchiae to DDT in Morocco: identification of the mechanisms and choice ofreplacement insecticide]. Eastern Mediterranean health journal = La revue de sante de la Mediterranee orientale = al-Majallah al-sihhiyah li-sharq al-mutawassit 2008, 14(4):776-783.

75.[76] Mostafa AA, Allam KA: Studies on the present status of insecticides resistance on mosquitoes using the diagnostic dosages in El-Fayium Governorate, a spot area of malaria in Egypt. J Egypt Soc Parasitol 2001, 31(1):177-186.

76.[77] Balkew M, Elhassan I, Ibrahim M, GebreMichael T, Engers H: Very high DDT-resistant population of Anopheles pharoensis Theobald (Diptera: Culicidae) from Gorgora, northern Ethiopia. Parasite 2006, 13(4):327-239.

77.[78] Yadouleton AW, Padonou G, Asidi A, Moiroux N, Bio-Banganna S, Corbel V, N'Guessan R, Gbenou D, Yacoubou I, Gazard K et al: Insecticide resistance status in Anopheles gambiae in southern Benin. Malar J 2010, 9:83.

78.[79] Pinto J, Lynd A, Vicente JL, Santolamazza F, Randle NP, Gentile G, Moreno M, Simard F, Charlwood JD, do Rosario VE et al: Multiple Origins of Knockdown Resistance Mutations in the Afrotropical Mosquito Vector Anopheles gambiae. PLoS onE 2007, 2(11):e1243.

79.[80] della Torre A, Fanello C, Akogbeto M, Dossou-yovo J, Favia G, Petrarca V, Coluzzi M: Molecular evidence of incipient speciation within Anopheles gambiae s.s. in West Africa. Insect Mol Biol 2001, 10(1):9-18.

80.[81] Weill M, Chandre F, Brengues C, Manguin S, Akogbeto M, Pasteur N, Guillet P, Raymond M: The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Molecular Biology 2000, 9(5):451-455.

81.[82] Reimer LJ, Tripet F, Slotman M, Spielman A, Fondjo E, Lanzaro GC: An unusual distribution of the kdr gene among populations of Anopheles gambiae on the island of Bioko, Equatorial Guinea. Insect Mol Biol 2005, 14(6):683-688.

82.[83] Protopopoff N, Verhaeghen K, Van Bortel W, Roelants P, Marcotty T, Baza D, D'Alessandro U, Coosemans M: A significant increase in kdr in Anopheles gambiae is associated with an intensive vector control intervention in Burundi highlands. Trop Med Int Health 2008, 13(12):1479-1487.

83.[84] Pinto J, Lynd A, Elissa N, Donnelly MJ, Costa C, Gentile G, Caccone A, do Rosario VE: Co-occurrence of East and West African kdr mutations suggests high levels of resistance to pyrethroid insecticides in Anopheles gambiae from Libreville, Gabon. Med Vet Entomol 2006, 20(1):27-32.

84.[85] Moreno M, Vicente JL, Cano J, Berzosa PJ, de Lucio A, Nzambo S, Bobuakasi L, Buatiche JN, ondo M, Micha F et al: Knockdown resistance mutations (kdr) and insecticide susceptibility to DDT and pyrethroids in Anopheles gambiae from Equatorial Guinea. Trop Med Int Health 2008, 13(3):430-433.

85.[86] Verhaeghen K, Van Bortel W, Roelants P, Backeljau T, Coosemans M: Detection of the East and West African kdr mutation in Anopheles gambiae and Anopheles arabiensis from Uganda using a new assay based on FRET/Melt Curve analysis. Malaria Journal 2006, 5(1):16.

86.[87] Koekemoer LL, Spillings BL, Christian RN, Lo TC, Kaiser ML, Norton RA, Oliver SV, Choi KS, Brooke BD, Hunt RH et al: Multiple insecticide resistance in Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Pointe Noire, Republic of the Congo. Vector Borne Zoonotic Dis 2011, 11(8):1193-1200.

87.[88] Reimer L, Fondjo E, Patchoke S, Diallo B, Lee Y, Ng A, Ndjemai HM, Atangana J, Traore SF, Lanzaro G et al: Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol 2008, 45(2):260-266.

88.[89] Badolo A, Traore A, Jones CM, Sanou A, Flood L, Guelbeogo WM, Ranson H, Sagnon N: Three years of insecticide resistance monitoring in Anopheles gambiae in Burkina Faso: resistance on the rise? Malar J 2012, 11:232.

89.[90] Santolamazza F, Calzetta M, Etang J, Barrese E, Dia I, Caccone A, Donnelly MJ, Petrarca V, Simard F, Pinto J et al: Distribution of knock-down resistance mutations in 624 Anopheles mosquitoes - New insights into malaria vectors Anopheles gambiae molecular forms in west and west-central Africa. Malar J 2008, 7(1): 74.

90.Ridl F, Bass C, Torrez M, Govender D, Ramdeen V, Yellot L, Edu A, Schwabe C, Mohloai P, Maharaj R et al: A pre-intervention study of malaria vector abundance in Rio Muni, Equatorial Guinea: Their role in malaria transmission and the incidence of insecticide resistance alleles. Malaria Journal 2008, 7(1):194.

91.Reimer L, Fondjo E, Patchok, Salomon, Diallo B, Lee Y, Ng A, Ndjemai HM, Atangana J, Traore SF et al: Relationship Between kdr Mutation and Resistance to Pyrethroid and DDT Insecticides in Natural Populations of Anopheles gambiae. Journal of Medical Entomology 2008, 45:260-266.

92.Matambo TS, Abdalla H, Brooke BD, Koekemoer LL, Mnzava A, Hunt RH, Coetzee M: Insecticide resistance in the malarial mosquito Anopheles arabiensis and association with the kdr mutation. Medical and Veterinary Entomology 2007, 21(1):97-102.

93.Kulkarni M, Rowland M, Alifrangis M, Mosha F, Matowo J, Malima R, Peter J, Kweka E, Lyimo I, Magesa S et al: Occurrence of the leucine-to-phenylalanine knockdown resistance (kdr) mutation in Anopheles arabiensis populations in Tanzania, detected by a simplified high-throughput SSOP-ELISA method. Malaria Journal 2006, 5(1):56.

94.Chen H, Githeko AK, Githure JI, Mutunga J, Zhou G, Yan G: Monooxygenase Levels and Knockdown Resistance (kdr) Allele Frequencies in Anopheles gambiae and Anopheles arabiensis in Kenya. Journal of Medical Entomology 2008, 45:242-250.

95.Etang J, Manga L, Toto JC, Guillet P, Fondjo E, Chandre F: Spectrum of metabolicbased esistance to DDT and pyrethroids in Anopheles gambiae s.l. populations from Cameroon. J Vector Ecol 2007, 32(1):123-133.

96.Hargreaves K, Hunt RH, Brooke BD, Mthembu J, Weeto MM, Awolola TS, Coetzee M: Anopheles arabiensis and An. quadriannulatus resistance to DDT in South Africa. Med Vet Entomol 2003, 17(4):417-422.

97.Amenya DA, Naguran R, Lo TC, Ranson H, Spillings BL, Wood OR, Brooke BD, Coetzee M, Koekemoer LL: Over expression of a cytochrome P450 (CYP6P9) in a major African malaria vector, Anopheles funestus, resistant to pyrethroids. Insect Mol Biol 2008, 17(1):19-25.

98.Somboon P, Prapanthadara LA, Suwonkerd W: Insecticide susceptibility tests of Anopheles minimus s.l., Aedes aegypti, Aedes albopictus, and Culex quinquefasciatus in northern Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health 2003, 34(1):87-93.

99.Verhaeghen K, Van Bortel W, Trung HD, Sochantha T, Coosemans M: Absence of knockdown resistance suggests metabolic resistance in the main malaria vectors of the Mekong region. Malar J 2009, 8:84.

100.Diabate A, Baldet T, Chandre F, Akoobeto M, Guiguemde TR, Darriet F, Brengues C, Guillet P, Hemingway J, Small GJ et al: The role of agricultural use of insecticides in resistance to pyrethroids in Anopheles gambiae s.l. in Burkina Faso. Am J Trop Med Hyg 2002, 67(6):617-622.