|
Phần II: Từ kháng trị thuốc giun sán trên gia súc đến cảnh báo tình hình kháng thuốc trên người không xa-một vấn đề chưa được quan tâm ở Việt Nam
Phần II: Cơ chế kháng thuốc điều trị giun sán
Cơ chế kháng của nhóm Benzimidazoles Cơ chế kháng thuốc được biết rõ nhất là nhóm BZ, thông tin chi tiết nói về cơ chế khángcủa giun móc/ mỏ ở người kháng với thuốc nhóm BZ còn hạn chế, nhưng các nhà ký sinh trùng thú y đã nghiên cứu kháng thuốc BZ một cách chi tiết trên loài giun H. contortus. Hoạt tính của nhóm BZ tác động nhờ sự gắn kết phân tử b-tubulin, can thiệp vào sự tổng hợp polymer hóa phân tử vi ống. Vài tác giả cho rằng có một tính đa hình của gen phân tử b-tubulin trong tính nhạy cảm với quần thể H. contortus: +Roos và cs chứng minh sự lựa chọn kháng với BZ là một sự khiếm khuyết alleles ở locus của b-tubulin isotype 1;Kwa và cs trình bày kháng với BZ có liên quan đột biến bảo tồn ở acide amin 200 trên phân tử b-tubulin isotype 1 (Phe đựợc thay bằng Tyr); +Sự đột biến giống nhau xảy ra ở nấm kháng BZ như Aspergillus nidulans và Venturia inaequalis. Thay thế các acide amine là có sự dị hợp phân tử b-tubulin isotype 1 (được phân lập từ chủng nhạy H. contortus (BZ-susceptible H. contortus) trong chủng kháng Caenorhabditis elegans. Biểu hiện di truyền gen H. contortus thay đổi kiểu hình của C. elegans chuyển gen từ kháng sang gen nhạy. Ngược lại, khi Phe được thay bằng Tyr ở vị trí 200 của gen này nhờ cơ chế sinh đột biến gen nên khi đó hoạt tính đảo ngược. Một cơ chế kháng thuốc thứ 2 được xác định trên một vài quần thể H. contortus cho thấy mức độ kháng cao hơn và trong đó có một sự cắt phân tử b-tubulin isotype 2 locus: +Beech và cs không thể xác định điều này trong các quần thể H. contortus khác. Những tác giả này cũng cho biết thay đổi trên tần suất allele hơn là sự tái sắp xếp do tiếp xúc với thuốc làm thay đổi liên quan đến kháng BZ. Một sự lựa dòng kháng với BZ theo hình bậc thang cũng xảy ra đối với quần thể ký sinh trùng Trichostrongylus colubriformis và Ostertagia circumcincta; +Kerboeuf và cs báo cáo về P-glycoproteins (P-gp) đóng vai trò trong kháng BZ ở H. contortus. P-gp liên quan đến đa kháng thuốc ở các tế bào u của đông vật có vú, Leishmania và Plasmodium và trong kháng với hợp chất độc tố ở C. elegans. Rhodamine 123, một đầu dò mang P-gp, liên quan đến tác nhân đảo ngược verapamil (một protein liên quan đến đa kháng thuốc ức chế), cho phát quang trong trứng của H. contortus kháng thuốc BZ một cách ý nghĩa và IVM hơn trong những trứng nhạy; những kết quả này có được qua các thử nghiệm sinh học thuốc chống giun sán và verapamil và làm tăng khả năng tràn dòng lệ thuộc P-gp trong trứng của giun tròn; +Kwa và cs sử dụng đầu dò P-gp từ ký sinh trùng H. contortus, không thể liên quan đến tính đa hình của bất kỳ kháng thuốc hoặc đa kháng thuốc nào được kiểm tra ở các quần thể H. contortus khác nhau, nhưng đáng chú ý DNA được dùng ở đây tách chiết từ ấu trùng giai đoạn 3 của giun sán mà không phải từ một ký sinh trùng riêng biệt nào, vì thế không ước đoán tần số allele có thể làm ra. Vì tính kháng đặc biệt của nhóm BZ dường như do đột biến điểm tương tự nhau trên một số loại nấm và giun tròn có tầm quan trọng trong lĩnh vực thú y, người ta không thể quy kết là có liên quan đến kháng trên người ở các loài giun tròn. Vì các phân tử giống nhau được sử dụng trong nghiên cứu y học thú y và trên người, điều đó sẽ rất có ích để phát hiện hoặc tìm kiếm sự có mặt một hay nhiều đột biến điểm ở loài giun sán trên người. Cơ chế kháng của Levamisole  |
Levamisole và những thuốc chống giun sán liên quan như pyrantel và morantel là các chất đối vận cholinergic (cholinergic agonists) với tác động lựa chọntrên các receptor của giun tròn. Cơ chế kháng của levamisole chưa được biết thấu đáo. Sangster đã tổng hợp hoàn toàn đặc tính dược học của kháng levamisole. Người ta cho rằng nguyên do có thể hoặc là giảm số lượng các receptor của nicotinic acetylcholinesterase hoặc giảm tính tương đồng về cấu trúc của các receptor này đối với thuốc. Hoekstra và cộng sự có thể dòng hóa gene Hca 1, mã hóa cho receptor của nicotinic acetylcholinesterase từ H. contortus. Mặc dù tính đa hình ở mức độ a.a có thể làm rõ điều này, các tác giả này không thể tìm thấy bằng chứng rằng các alleles ở vị trí locus đó có liên quan sự lựa chọn kháng thuốc vớilevamisole. Một gen tương tự là tar-1 được xác định trên nhiễm sắc thể X trong loàiT. colubriformis. Tuy nhiên, mặc dù sự so sánh có tính thống kê của nhiều tần số allele từ những con giun cái và giun đực riêng lẻ phù hợp với liên kết giới tính của tar-1, không thấy mối liên quan nào tìm thấy có kháng levamisole. Cơ chế kháng của Ivermectin IVM và các thuốc có vòng macrocyclic lactones khác tác động lên các giun tròn đường tiêu hóa thông qua sự làm đói (starvation) và/ hoặc gây liệt giun bằng cách mở kênh chloride (chloride channels), điều này được nghĩ là liên quan đến các alfa-subunits củacác kênh glutamate-gated ion nằm ở cơ của hầu họng và có thể cả hệ cơ của cơ thể giun. Rohrer và cộng sự so sánh giữa kháng và nhạy của IVM với quần thể ký sinh trùng H. contortus và tìm thấy kháng đó không do sự thay đổi trong vấn đề liên kết thuốc IVM với các receptor của kênh glutamate gated chloride. Tuy nhiên, Blackhall và cộng sự đã báo cáo về tình trạng 1 allele của putative alfa-subunit gene giả định có liên quan đến kháng thuốc. Gần đây, Blackhall và cộng sự báo cáo sự khác biệt di truyền đáng quan tâm về một locus P-gp trên ký sinh trùng H. contortus. Trên một vài dòng ký sinh trùng kháng thuốc lựa chọn, việc chọn ra các allele cũng đã phát hiện. Sử dụng các tiếp cận khác, Xu và cộng sựvà Sangster và cộng sự đi đến kết luận rằng phân tử P-gp có thể liên quan đến kháng thuốc IVM ở các loài giun sán này. Những cơ chế kháng khác cũng được Gill và cộng sự và Gill & Lacey trình bày. Năm (5) hình thức kháng thuốc với IVM ở loài ký sinh trùng H. contortus đã được mổ tả sau đó dựa trên cách tác động khác nhau trên in vitro test (thử nghiệm ấu trùng phát triển và thử nghiệm di động của ấu trùng giai đoạn 3), Độ nhạy cảm cũng khác nhau với thuốc paraherquamide (một loại thuốc có cấu trúc và bị trí gắn proteine khác hoàn toàn với IVM) và kế thừa khác nhau (ít nhất 2 trong số 5 loại kháng). Gill và Lacey cũng cho thấy rằng cơ chế kháng với IVM có thể khác nhau giữa các chủng giunNày với giun khác, bởi vì các trường hợp chính đáng dẫn đến sựtống xuất giun sán cũng thấy khác nhau, chẳng hạn khi so sánh giữa O. ostertagi vớiH. contortus và T. colubriformis. Các nghiên cứu tiếp theo đòi hỏi xác định các nghiên cứu làm rõ những tình huống tương tự như O. volvulus trên người vẫn chưa rõ ràng. Di truyền về kháng thuốc (genetics of drug resistance) Đối với giun tròn Quần thể ký sinh trùng (KST) giun tròn sinh trưởng dị hình về mặt di truyền, nên có thể đáp ứng với áp lực lựa chọn thuốc. Áp lực thuốc lan rộng sẽ là một điểm tốt và lựa chọn các dòng KST mang tính dung nạp hoặc các allele kháng thuốc. Tỷ lệ kháng thuốc lan rộng trong quần thể KSTtùy vào nhiều yếu tố, 1 trong những yếu tố chính là tỷ lệ KSTsống sót sau điều trị sẽ lan truyền đến cho thế hệ tiếp theo. Yếu tố này bị ảnh hưởng bởi áp lực thuốc (số lần và thời gian điều trị),hiệu lực thuốc, dòng gen (kiểu gen nhạy cảm từ một nơi nào đó), thời gian chuyển thế hệ và khả năng sinh sản của giun, tần số allele kháng trước khi sử dụng thuốc, lượng gen liên quan và tính trội cũng như tính lặn các gen này. Thật khó để xác lập mô hình kiểm chứng ảnh hưởng của yếu tố này, nên vài mô hình toán học được đưa ra để kích quá trình KTGS đường ruột. Dù mô hình này có giới hạn và phải phiên giải cẩn thận (ví dụ mô hình của Barnes và cs liên quan giun lươn Trichostrongylus colubriformis) ở cừu. Mô hình cho phép 3 gen kháng thuốc, mỗi gen có 2 alleles, kết hợp độc lập dưới kết dính ngẫu nhiên, những con giun của tất cả kiểu hình được thừa nhận tương đối phù hợp khi có sự vắng mặt của thuốc chống giun. Tần số đầu tiên của các alleles kháng trong quần thể giun được xác định là rất thấp, chứng (0.01%). Để kiểm tra hiệu quả của sử dụng hợp chất của 2 thuốc hoặc 1 thuốc luân phiên, hai gen độc lập kháng 2 thuốc (với cơ chế hoạt động khác nhau) được kích thích, với kháng ở codominant và mỗi thuốc giết 99; 50; và 10% số giun của kiểu gen lần lượt của chủng nhạy đồng hợp tử (homozygous susceptible_SS), dị hợp tử (heterozygous_RS) và kháng dị hợp tử. Sự kích thích này được tiến hành trong một thời gian dài 20 năm với liệu trình điều trị 1lần/ năm đối với cừu cái và 3 lần/ năm với cừu non. Điều này dẫn đến một số ít kháng thuốc khi 2 thuốc phối hợp nhau. Tuy nhiên, kháng thuốc xảy ra đối với chiến lược dùng thuốc đơn thuần luân phiên, mỗi 1 năm ,5 năm và 10 năm tương ứng với quá trình phát triển kháng thấp nhất. Hiệu quả của thuốc được thừa nhận và tần số allele kháng phát triển nhanh chóng nếu nó được xác định bởi một gen duy nhất hơn là khi hai hay nhiều gen liên quan. Ngoài ra, kháng thuốc biểu hiện nhanh nhất khi đó là gen trội, chậm hơn khi nó đồng trội (codominant) và chậm nhất khi nó là gen lặn ( recessive). Khi 20% của số đàn cừu chưa bao giờ đươc điều trị, thì tình hình kháng sẽ trì hoãn và công tác phòng chống được tốt hơn. Tuy nhiên, chúng ta nên chú ý rằng mô hình này và một số mô hình khác trước đâyphân bố và lạm dụng quá mức ở tất cả giai đoạn của KST giun sán. Smith và cs dùng một mô hình để xác định hiệu quả của phân bố tập trung KST kết hợp với khả năng và lan rộng và bảo tồn kiểu gen kháng rất hiếm. Họ kết luận rằng tính dị hợp trong không gian ở vùng lan truyền có thể là động lực thúc đẩy tạo ra kiểu gen kháng thuốc, ít nhất khi mức độ nhiễm trùng thấp. Khi thực hiện mô hình để so sánh với các kiến thức di truyền hiện tại về kháng thuốc giun sán ở gia súc, sự chú ý và quan tâm nhất là tần số allele kháng cao được tìm thấy trong quần thể giun sán gia súc chưa được điều trị có tầm quan trọng trong thú y. Beech và cs phân tích kiểu gencác cá thể nhạy với H. contortus trước khi có bất kỳ phơi nhiễm nào với thuốc nhóm BZ và các tần số ban đầu đã được báo cáo kháng của lần lượt allelelà 46 và 12% ở isotype 1 và isotype 2 tại locus -tubulin. Anderson và cs cho biết các tần số cao có liên quan đến kháng IVM có thể xảy ra ở những dòng không lựa chọn của các chủng giun sán giống nhau. Số liệu của tác giả Beech và cộng sự có thể quá mức nhưng họ chỉ ra các alleles kháng ở quần thể giun sán trên gia súc mà chưa được điều trị và có lẽ cũng trên người và có thể thường gặp hơn mô hình có tính chất giả thuyết. Các báo cáo tương phản, trái ngược nhau được đăng trên tạp chí đề cập đến số lượng gen liên quan đến kháng thuốc giun sán và tính trội cũng như tính lặn của chúng. Những thông tin có sẵn, chủ yếu về KST H. contortus, đã được tóm tắt bởi tác giả Anderson và cs. Kháng nhóm BZ trong KST này là đa gen; ít nhất 2 gen và có thể là 3 gen, các gen này có các allele lặn liên quan. Kháng thuốc levamisole ở loài H. contortus và T. colubriformis có khả năng do 1 gen chính duy nhất hoặc 1 chùm gen, các allele của gen này là lặn đối với các allele lặn liên kết giới tính và thế hệ trước. Đối với kháng IVM ở loài H. contortus là qua trung gian bởi 1 gen duy nhất hoặc phức hợp gen có hiệu ứng trội ngay ban đầu. Do vậy, kháng IVM có thể phát triển nhanh chóng, kháng thuốc Avermectin và mylbemycin hiện nay đang lan rộng ở loài H. contortus và O. circumcincta của các loài động vật nhai lại trên khắp thế giới nhưng kháng không đáng kể ở loài T. colubriformis. Một cách rõ ràng, kinh nghiệm và thử nghiệm trong lĩnh vực thú y có liên quan chặt chẽ khi nghiên cứu trên người. Sự hiện diện của các dòng dung nạp (tolerant strains) với các thuốc điều trị giun sán ở bất kỳmột quần thể KST nào, những nghiên cứu về sinh học và phép ngoại suy thống kê cho tỷ lệ của những thuốc chống giun sán kháng bẩm sinh thường lớn hơn tỷ lệ phần trăm có thể (10 2), không phải 10 3 hoặc ít hơn như chúng ta suy nghĩ trước đây. Hầu như tất cả chiến lược được đề nghị nhằm phòng chống bệnh giun sán trên người dựa trên tiếp cận một thuốc duy nhấtkhông có thuốc phối hợp hoặc sử dụng luân phiên và một tần số tối thiểu là 1lần/ năm là quá dài. Mặc dù tình hình gia súc khác so với con người và kết quả hoặc các khuyến cáo không thể ngoại suy một cách tự động cho rằng về tính chất sinh học, dịch tễ học và dược lý học là hoàn toàn tương tự. Việc nghiên cứu nên tập trung vào di truyền học tương đồng các kiểu hình liên quan với kháng thuốc trên gia súc và trên người. Các loài sán lá Di truyền về kháng thuốc của sán máng với oxamniquine được biết thấu đáo, nhưng điều này lại chưa rõ ràng đối với trường hợp sán máng với PZQ. Ngược với sự phát triển và hình thành cơ chế kháng thuốc cổ điển ở giun sán, thì điều này lại lan rộng dần dần trong cả quần thể như hậu quả tất yếu của sự lựa chọn kiểu hình kháng thuốc ở tần số thấp, kháng với thuốc hycanthone-oxamniquine xuất hiện quy mô toàn cầu lần đầu tiên như thế hệ cha truyền con nối của các KST đã phơi nhiễm với thuốc. Hướng đề nghị cho rằng kháng thuốc gây ra hơn là lựa chọn từ các thể đã tồn tại từ trước, thử nghiệm sinh sản chéo đã làm rõ về kháng thuốc oxamniquine được kiểm chứng bởi một gen lặn nhiễm sắc thể thường (Cioli và cs; Pica-Mattocia và cs.,2000). Kháng oxamniquine không dễ dàng lan rộng trong cộng đồng nhưng có xu hướng duy trì trên một số cá thể có giới hạn. Theo Cioli và cs, điều này có thể do các bất lợi của lựa chọn kháng thuốc do sán máng trong khi không có áp lực thuốc, thực tế kháng là do tự nó hơn là do lựa chọn. Một số ít biết về nền tảng di truyền và sinh hóa của kháng vớiPZQ. Gần đây, sự phân định về di truyền được làm rõ giữa dòng KST sán mángS. mansoni trong labô được lựa chọn cho kháng với PZQ và dòng nhạy của thế hệ cha mẹ. Mặc dù các tác giả này không phát hiện bất kỳ một sự tái sắp xếp bộ gen chính nào trên những dòng KST này, giải mã mRNA một đoạn của subunit1 của enzyme cytochrome oxidase trải rộng ra gấp 5-10 lần trên những dòng kháng so với dòng nhạy. Các nghiên cứu tiếp theo là cần thiết để kiểm tra có hay không một hiện tượng tương tự cũng hiện diện trong những dòng này tại thực địa mà nghi ngờ là kháng thuốc PZQ và những gen kháng cũng biểu hiện khác biệt trên những dòng kháng của sán máng S. mansoni. Phát hiện kháng thuốc: Thử nghiệm đếm trứng giảm đi trong phân (FECRT_Fecal egg count reduction test) Test để phát hiện KTGS cho phép so sánh trước và sau khi điều trị với một loại thuốc chống giun sán. Một đề cương chuẩn để áp dụng choFECRT đã có sẵn cho các loại giun tròn có tầm quan trọng về mặt thú y. Trên động vật nhai lại, những mẫu phân được lấy từ hai nhóm ít nhất của 15 con, chọn những con còn non hơn được nuôi trên nông trại và chưa điều trị trước đó 8-12 tuần. Những động vật này được phân bố ngẫu nhiên vào một nhóm điều trị (nghiên cứu) và một nhóm chứng. Những mẫu phân được thu thập từ ngày thứ 10 đến 14 sau điều trị. Để giảm tải công việc, những mẫu phân trước điều trị không lấy (pretreatment samples); điều đó sẽ so sánh giữa nhóm chứng và nhóm sau điều trị (posttreatment) sẽ rất đáng tin cậy khi so sánh trước và sau điều trị. Đếm trứng giun theo phương pháp McMaster chuẩn, đếm lượng trứng/ 1g phân của nhóm chứng sẽ cao hơn 150 thì giá trị so sánh mới hợp lý. Công thức sau được dùng để tính % lượng trứng giảm: ERR = 100(1Xt/Xc), X là trung bình số học EPG; c và t lần lượt là nhóm chứng và nhóm điều trị. Theo hướng dẫn của WAAVP, kháng thuốc giun sán ở các động vật nhai lại được công nhân khi ERR <95% và độ tin cậy (CI< 95%) là < 90%. Nếu 1 trong 2 tiểu chuẩn này đạt thì kháng thuốc khi đó được nghi ngờ. Protocol này hướng dẫn triển khai một tiếp cận chuẩn cho kháng thuốc giun sán ở người, nhưng phải có sự thay đổi bởi vì sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa động vật và người. Để bắt đầu điều này, các đối tượng nghiên cứu phải khác: ở gia súc, thử nghiệm được sử dụng xác định thường quy tại chỗ để biết kháng thuốc; song trên người, những thử thách vẫn còn đó khiến cho kháng thuốc tồn tại. Ngoài ra, quần thể nghiên cứu người thì dị hợp hơn nhiều so với động vật: có một sự thiếu phối hợp trong quy trình theo dõi, thu thập mẫu làm bằng chứng, hành vi của cá nhân (liên quan đến phơi nhiễm cũng như những hành vi liên quan đến sức khỏe) có thể tác động quan trọng trên các thông số thử nghiệm hoặc chủng giun nhiễm vào người khác cho nên đòi hỏi có phương pháp xét nghiệm phân khác. Vấn đề phương pháp nghiên cứu đã được trải nghiệm trong quá khứ để xác định kháng thuốc giun sán trên người, một protocol chuẩn để phát hiện kháng thuốc trên người dưới điều kiện thực địa có thể bao gồm một số yếu tố chuẩn hóa như nhóm nghiên cứu và phương pháp ký sinh trùng. (i)Nhóm nghiên cứu và nhóm chứng (Study and control groups) Những nghiên cứu để xác định các trường hợp nghi ngờ kháng thuốc, đặc biệt thuốc là hợp chất thì chưa bao giờ có báo cáo nào đáng tin cậy, nên phải gồm ít nhất 1 nhóm điều trị (nghiên cứu) và một nhóm không điều trị (placebo); -Tốt hơn, một nhóm chứng dương tính, điều trị với một nhóm khác, không liên quan và dự đoán hiệu lực thuốc cũng nên đưa vào tiêu chuẩn. Các thuốc nên có nguồn gốc rõ ràng và chất lượng tốt; các khuyến cáo này nên đưa vào sử dụng trên lâm sàng, không nên sử dụng dưới liều (subcurative doses) mà áp dụng vào trong việc phòng chống bệnh dựa vào cộng đồng, với liều thích ứng cho từng trọng lượng cơ thể; -Thuốc phải nuốt dưới sự giám sát trực tiếp; đặc biệt dùng syrup hoặc dạng nhũ dịch với lượng thích hợp cho trẻ em. Những người bị nôn hoặc tiêu chảy nặng trong thời gian ngắn từ khi uống thuốc điều trị sẽ loại khỏi nghiên cứu thuần tập. Ngoại trừ lý do độc tính của thuốc, phụ nữ có thai và những người có bệnh hệ thống cũng nên loại trừ vì động lực của miễn dịch KST cũng như dược lý học có khả năng làm nhiễu các thông số theo dõi; -Các nghiên cứu dược động học không cần thiết từ ban đầu nhưng nên thực hiện trước khi kết luận về kháng thuốc. -Cỡ mẫu xác định bằng cách dùng 1 phân tích thống kê đa năng dựa trên giả thuyết định lượng; chẳng hạn, với mỗi thuốc điều trị giun sán được thử nghiệm, giá trị CR và ERR nên xác định trước. Vì như vậy, sẽ làm rõ các bàn luận ở trên. -Thành phần nhóm nghiên cứu phải tương đồng về mặt thống kê tuổi, giới, số lượng trứng đếm trung bình trước khi điều trị và ngay cả phân bố trung bình. Trẻ em và người lớn nên tính toán vào các quần thể khác nhau. Các yếu tố nhiễu khác có khả năng đưa đến như yếu tố phân lớp kinh tế xã hội, nghề nghiệp, tôn giáo, lứa tuổi đi học để chúng ta loại trừ bớt; -Một cách lý tưởng là các nhóm nên lựa chọn từ nhiều hơn hoặc ít hơn quần thể dị hợp (heterogeneous population), chẳng hạn một làng và phải nghiên cứu đồng thời để tránh sự khác biệt về không gian và thời gian lan truyền bệnh. Không có đối tượng nào trong nghiên cứu nhận điều trị với bất kỳ một thuốc giun sán hoặc hợp chất trong 3 tháng trước (đối với giun tròn) và 12 tháng (đối với sán máng), vì như thế có thể ảnh hưởng quy trình của sự tái lập lượng KST trong số họ; -Đưa ra những yêu cầu và tỷ lệ loại khỏi nghiên cứu của các đối tượng; cỡ mẫu ban đầu nên ít hơn 50/1 nhóm nghiên cứu, nếu chỉ đối với các thử nghiệm có giá trị cho mô hình phân phối của đếm trứng. Trứng đếm trước điều trị nên đủ lớn để phiên giải kết quả có ý nghĩa thống kê; -Khía cạnh y đức phải được nêu ra (bản đồng ý của đối tượng, cha mẹ hoặc người giám hộ), điều trị cho những ca chứng (-) ngay sau khi theo dõi hoặc sớm hơn nếu tình trạng lâm sàng cần thiết điều trị; quản lý và giám sát các tác dụng phụ, cho nhập viện kịp thời nếu cần thiết. (ii)Phương pháp xét nghiệm ký sinh trùng trong đánh giá kháng thuốc Một kỹ thuật đếm trứng chuẩn nên áp dụng để xác định lượng trứng trong phân (epg) của mỗi cá nhân. Đối với sán máng, giun đũa và giun tóc thì phương pháp chuẩn là kỹ thuật Kato ( Peters và cs; Polderman và cs). Các lam phân được bảo quản cẩn thận để đối chiếu và kiểm tra chất lượng sau đó. Với giun móc, hết sức cẩn thận với kỹ thuật Kato chuẩn xác. Tác giả Martin và Beaver khuyên nên đọc kết quả lam sau 30 phút và không được sau hơn 60 phút sau khi làm lam kính xong vì cả hai đều làm ảnh hưởng hoặc nhiễu giá trị. Song, điều này dựa trên một vài mẫu phân trên lâm sàng thì được nhưng ở thực địa, tính ổn định và độ trong suốt của mẫu phân có thể khác nhau giữa nghiên cứu trên cá nhân và cộng đồng. Bất kỳ trường hợp nào, lam phân Kato có lượng phân hơn 25mg như trong kỹ thuật Kato-Katz chuẩn, có thể sẽ khó đọc kết quả sau 1 giờ và vì vậy không phù hợp cho nghiên cứu đếm trứng giun móc chuẩn xác được. Đọc tất cả lam phân trong một khoảng thời gian ngắn sau khi chuẩn bị đòi hỏi các nhà nghiên cứu ở thực địa chuẩn bị và tổ chức một cách khoa học; Một cách lý tưởng, kỹ thuật Kato đáp ứng nhu cầu cho đếm trứng giun móc có thể bảo tồn tính cổ điển hoặc cải cách so với FECRT trong lĩnh vực thú y. Nhu cầu lớn đòi hỏi để triển khai là tính khách quan và tính hợp lệ cho một protocol chuẩn mà không cần thêm nghiên cứu thực địa về kháng thuốc giun sán trên giun móc sẽ vẫn là khiếm khuyết nghiêm trọng. Đếm trứng sẽ cho thấy khác nhau từ ngày này qua ngày khác, giữa cá nhân này với cá nhân khác và tại chính cá nhân đó rõ nét trên cả giun tròn và sán máng. Để thu thập trứng sán máng chính xác hơn ở mức độ cá nhân, tối thiểu phải 3 mẫu phân được lấy để xét nghiệm. Nếu tập trung vào chỉ số CR (khỏi bệnh), phương pháp định lượng trứng trong phân nhạy nhất nên áp dụng kết hợp với 1 phương pháp định lượng khác như phương pháp lắng có glycerine cho sán máng và cấy phân cho giun móc. Phương pháp định tính là cần thiết làm trên những mẫu phân bổ sung để xác định chính xác. Phiên giải kết quả đếm số lượng trứng trung bình theo thống kê rất phức tạp.Tính chính xác trong khoa học đòi hỏi sử dụng mô thức liên quan giữa đếm trứng giun với lượng giun trên người, thông số kết quả của điều trị sẵn có. Sử dụng trực tiếp chỉ số EPG cho ta một mối liên quan tỷ lệ, mà điều này không hề đúng với thống kê học và sinh học. Công cụ thống kê thực hành để mà kết luận không bao giờ cũng dễ và sẵn có mà chỉ có ở loài sán máng. Nói một cách đơn giản, số lượng trứng trung bình có thể áp dụng để phân tích số liệu thô ban đầu và có đủ để loại giả thuyết kháng thuốc hay không. Tuy nhiên, những kinh nghiệm tiến hành ở người Senegal với thuốc PZQ lại đươc phân tích một cách chi tiết hơn. Trong khoa học thú y, trung bình số học của trứng đếm được áp dụng hơn là trung bình hình học bởi lẽ chúng sẽ nhạy hơn và cho phép phát hiện KTGS sớm hơn. Điều này có thể chính đáng trong những tình huống nơi mà KTGS được biết tồn tại; tuy nhiên, về mặt thống kê thì trung bình số học lại không có giá trị do đếm trứng giun sán tập trung, kếp tập lại quá chặt, điều này thường theo một phân bố nhị thức âm tính (negative binomial distribution). Trung bình hình học thích hợp hơn mặc dù chưa lý tưởng lắm vì mô hình phân bố thay đổi sau khi chúng ta can thiệp. Khoảng cách thời gian mỗi lần điều trị và thu thập mẫu phân phải thích hợp cho từng chủng loại KST và từng loại thuốc sử dụng. Chẳng hạn, để đánh giá hiệu quả thuốc nhóm BZ trong điều trị giun móc/ mỏ, một khoảng cách khoảng 2 tuần là thích hợp, thời gian lâu hơn sẽ cho phép thể chưa trưởng thành thậm chí một nhiễm mới trở nên là nguồn KST khó xác định và ngược lại khoảng thời gian ngắn hơn sẽ cho chúng ta đánh giá quá mức về hiệu lực thuốc (overestimate efficacy), vì một vài thuốc tạm thời ức chế sinh sản trứng mà không thể giết chết giun sán. Đối với sán máng, vấn đề phân biệt thể hoạt động với thể chưa trưởng thành hoặc thậm chí tình trạng nhiễm trong quá khứ đến mức độ nào đó sẽ rất phức tạp. Vì sán sống trong mạch máu nhỏ, trứng sán chảy theo một đường từ vi trí trong tĩnh mạchđến bên ngoài và có thể thải trứng đến 6-8 tuần hoặc thậm chí dài hơn sau khi sự sinh sản của chúng bắt đầu. Phương pháp Kato không phân biệt được trứng đã chết hay còn sống. Mặc khác, nhiễm các thể chưa trưởng thành, điều này không ảnh hưởng bởi PZQ, có thể trở nên rõ ràng ở nhiều ngày sau khi điều trị thành công sán trưởng thành và nhiễm KST gần đây có thể dẫn đến đào thải trứng trong vòng 4-6 tuần. Giải pháp lý tưởng cân nhắc các bệnh nhân đang nằm ngoài vùng lưu hành và để đánh giá chữa khỏi sau 8-12 tuần hoặc thậm chí dài hơn. Thực tế, điều này chỉ xảy ra cho các du khách là những người thường nhiễm nhẹ không biểu hiện triệu chứng. Tuy nhiên, kết quả phải luôn phiên giải và chú ý đến khả năng tái nhiễm nhẹ (gồm sự trưởng thành của các thể tiềm tàng) ở những vùng lan truyền cao. Nếu có thể, thử nghiệm điều trị sẽ xảy ra ở những mùa không lan truyền hoặc lan truyền thấp. Việc xác định số lượng kháng nguyên lưu hành, đặc biệt trong huyết thanh có thể đóng vai trò như một công cụ bổ sung hữu ích. Chữa khỏi có thể được đánh giá trong vài ngày đến một tuần sau điều trị nhưng kém nhạy hơn vì tái nhiễm nhanh chóng. Tuy nhiên, phương pháp phát hiện kháng nguyên không thể hoàn toàn kỹ thuật đếm phân, vì 5-30% nhiễm giun sán vẫn còn bỏ sót; kítxét nghiệm kháng nguyên đã sẵn có trên thị trường song về cơ sở hạ tầng labô nhiều hơn phương pháp đếm phân. Để rõ ràng từng vấn đề trên với số liệu hợp lệ nhằm xác định KTGS ở thực địa đòi hỏi phải có tính chuyên sâu về KST và dịch tễ học, đội nghiên cứu được đào tạo tốt, tổ chức cẩn thận và kiểm tra chất lượng chặt chẽ và đó là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao và thiết lập các phương pháp phù hợp và protocol chuẩn. Các thử nghiệm tại labô để phát hiện KTGS trên gia súc Một số thử nghiệm khác nhau đựợc mô tả để phát hiện KTGS trên gia súc. Một số trong các XN đó có thể áp dụng trong đánh giá KTGS trên người: (i) Thử nghiệm nở trứng (EHT_Egg hatch test) -Thử nghiệm làm nở trứng là một thử nghiệm in vitro, chỉ sử dụng để phát hiện kháng thuốc cho nhóm BZ ở gia súc; như thế người ta dựa vào hoạt độ diệt trứng (ovicidal activity) của các phân tử nhóm thuốc này. Thử nghiệm kinh điển do Le Jambre mô tả, 1 protocol chuẩn được đề ra bởi WAAVP. Mẫu phân thu thập phải tươi (trong vòng 3 giờ sau khi đại tiện) khi đó số liệu mới đáng tin cậy. Nếu không thể làm ngay, các mẫu phân phải được cất giữ trong môi trường kỵ khí; khâu cất giữ sẽ không làm ảnh hưởng đến kết quả XN, ít nhất là không làm ảnh hưởng đến các loại giun sán trong đường tiêu hóa của động vật. Trứng giun được làm tinh khiết và ủ trong một loạt các môi trường của thiabendazole (TBZ). Hợp chất này được lựa chọn bởi vì nó hòa tan nhanh chóng trong dimethyl sulfoxide và kháng thuốc thường có mặt một số nhóm thuốc khác với nhóm BZ. Sau 24 giờ, lượng ấu trùng được đẻ ra sẽ cho đếm. -Khi xuất hiện kháng thuốc, hoạt độ diệt trứng giảm, phần trăm trứng đẻ ra sẽ cao hơn. Dựa vào những kinh nghiệm về thử nghiệm này, tổ chức WAAVP cho biết kháng thuốc xuất hiện khi liều hiệu quả 50% 0.1µg/ml. Điều này trên in vitro có lợi ngay cả chỉ có một mẫu phân. -FECRT và test đẻ trứngphát hiện KTGS chỉ khi ít nhất 25% quần thể giun sán mang gen kháng thuốc như là gây nhiễm nhân tạo trên những động vật với quần thể giun sán với một mức độ kháng thuốc biết trước. Vì sự trở lại tính nhạy là có thể, miễn là gen kháng thuốc có mặt ít hơn 5% trong tổng số quần thể, FECRT và thử nghiệm đẻ trứng cho phép phát hiện kháng thuốc chỉ khi nào quá muộn để can thiệp vào. Số liệu thực địa và thực nghiệm của giun sán trên gia súc bổ sung chỉ ra sự nhạy trở lại với các thuốc chống giun sán trên gia súc. (ii) Thử nghiệm phát triển ấu trùng (LDA_Larval development assay) Thử nghiệm LDA đòi hỏi chuyên cần và tốn nhiều thời gian hơn thử nghiệm đẻ trứng nhưng cho phép phát hiện kháng với một phổ rộng giun sán (broad-spectrum anthelmintic classes) chủ yếu, bao gồm avermectins-mylbemycins. Thử nghiệm LDA được mô tả bởi Coles và cs và được cải tiến bởi một vài tác giả khác thành test thương mại có sẵn trên thị trường. Trong thử nghiệm phát triển ấu trùng, trứng của giun tròn hoặc ấu trùng L1 phơi nhiễm với nồng độ thuốc thuốc giun sán khác nhau không tương ứng với các giếng trên thạch agar nhưng trong các plate thử thuốc. Hiệu quả của thuốc lên lên trên quá trình phát triển chuyển dạng thành ấu trùng giai đoạn 3. Kết quả liên quan rất chặt chẽ với các thử nghiệm trên in vivo test.Người ta khẳng định thử nghiệm này nhạy hơn FECRT và test đẻ trứng phát hiện kháng thuốc khi 10% quần thể giun mang gen kháng thuốc, nhưng điều này nên mở rộng nghiên cứu để chứng minh. (iii) Thử nghiệm làm bất động ấu trùng (Larval motility or paralysis test) Mọt vài thử nghiệm in vitro phát hiện kháng thuốc nhóm BZ, macrocyclic lactones hoặc levamisole-morantel đã được mô tả dựa trên tính di động của ấu trùng. Đối với những nhóm thuốc giun sán mới sau này thì để phân tích sự khác biệt giữa dòng nhạy và kháng không phải luôn luôn dễ dàng. Một thử nghiệm về tính di động đượcáp dụng để đánh giá độ nhạy của các ấu trùng O. volvulus với thuốc ivermectin. Để phiên giải kết quả trên nhiều đối tượng, một phép đo vi thểđược áp dụng. Folz và cs sử dụng bộ dụng cụ này để phát hiện kháng thuốc trên loài H. contortus và T. colubriformis, nhưng hiệu quả của phương pháp còn chưa tin cậy. (iii)Kỹ thuật sinh học phân tử PCR (polymerase Chain Reaction technique) Những mồi đặc hiệu đầu tiên để phát hiện KST giun tròn kháng thuốc được triển khai bởi Kwa và cs. Các mồi này có tính chính xác giữa heterozygous and homozygous của H. contortus kháng BZ đối với các allelel là -tubulin isotype 1, thậm chí khi các kiểu gen này khác biệt về kiểu hình và cũng có thể nhận dạng kháng nhóm BZ của T. colubriformis. Theo Roos và cs, PCR phát hiện 1% cá thể kháng trong một quần thể giun nhạy, chính là ưu điểm hơn in vivo và in vitro test. -Gần đây, Elard và cs triển khai một phương pháp đơn giản để chẩn đoán kháng thuốc nhóm BZ của O. (Telodorsagia) circumcincta. Sử dụng 4 cặp mồi (2 đặc hiệu alen và 2 đặc hiệu không alen (2 -specific and two nonallele-specific ones) trong cùng một phản ứng PCR, giun trưởng thành được đặc trưng bởi đột biến phân tử 200 của isotype 1 -tubulin tồn lưu. Kỹ thuật nay đã được cải tiến để áp dụng cho từng loại giun, trứng giun riêng biệt hoặc ấu trùng (M. H. Roos, 2000). Vì tần số các alleles liên quan với KTGS có thể rất cao ngay cả trên quần thể KST nhạy, điều đó rất quan trọng nếu chúng ta bổ sung dữ liệu DNA của mỗi loại KST. Nếu DNA được tách chiết từ KST hỗn hợp, thì sự phối hợp giữa các allele đặc biệt có thể sẽ phân tích không có ý nghĩa. -Vì đột biến giống nhau chịu trách nhiệm việc kháng nhóm thuốc BZ trong nhiều loài giun tròn, phương pháp này có thể cho chúng ta một công cụ điều tra tần số các allele có ưu thế trong số đông ký sinh trùng giun tròn trên người và trên động vật. -Một sự kỹ thuật phát triển tuyệt vời khác là hiện đã có sẵn các đầu dò gen (P-gp gene probe) cho phát hiện Onchocerca volvulus. Vì nó chỉ ra P-gp đóng một vai trò trong kháng thuốc nhóm BZvà IVM ở H. contortus, người ta hy vọng rằng cơ chế phát hiện kháng thuốc giống nhau có thể phát triển trên nhiều loài giun sán khác trong tương lai. Thử nghiệm tại labo để phát hiện kháng thuốc giun sán trên người Trừ test đẻ trứng đối với giun móc/ mỏ ở nghiên cứu Mali, in vitro test cho kháng thuốc ở loài giun tròn trên người có giá trị trong một giới hạn hợp lý nào đó. Vấn đề chính là thiếu dòng kháng để tham khảo. Nếu sẵn có, test đẻ trứng và thử nghiệm phát triển ấu trùng cũng như kỹ thuật PCR dễ dàng đánh giá kháng thuốc trên giun móc/ mỏ ở người. -Những thử nghiệm tại labo đối với kháng thuốc điều trị sán máng, đặc biệt với PZQ, bao gồm chủ yếu đếm lượng sán giảm đi sau khi điều trị ở mô hình phòng thí nghiệm gây nhiễm trên chuột. Trước tiên, phải nhấn mạnh rằng chuột trắng là vật chủ không phải tự nhiên nhiễm sán máng cao; một lượng sán nằm trong máu là một vật thể lạ khổng lồ trong mạch máu của chuột nhỏ. Tỷ lệ cân xứng là 1 con sán duy nhất trong một con chuột (thể tích máu 5ml) tương ứng với 10.000 con sán trong một người trưởng thành (thể tích máu 5lít máu). Một vài con chuột sống sót với lượng sán nhiều như thế trong thời gian dài đủ cho phép thử nghiệm điều trị, do vậy hiệu lực thống kê vốn đã giới hạn càng giới hạn hơn. Những dòng trong labô thường được duy trì và bảo tồn sử dụng trứng từ những gan chuột bị nhiễm trong 5-6 tuần, dẫn đến lựa chọn KST trưởng thành nhanh chóng hơn và trở nên nhạy với PZQ sớm hơn (hơn cả dòng tự nhiên). Như trên đề cập, sai số như thế có thể giải thích những báo cáo đầu tiên về kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc do điều trị với PZQ ở phòng thí nghiệm. Không dễ dàng gì phân lập các KST hỗn hợp, kháng hay không kháng. Thường thìchuột bị nhiễm một phức hợp cercariae từ ít nhất 5 con ốc để thu thập cả 2 giới có điều kiện sinh sản. Những con ốc này thường phơi nhiễm với 3-5 miracidia, dẫn đến nhiễm phối hợp. Các miracidia này, thậm chí nếu phân lập từ phân của1 người cũng không đáp ứng tốt với điều trị. Vì vậy, việc xác định và đánh giá kháng thuốc trong một mô hình như vậy sẽ rất đơn điệu và công việc tẻ nhạt. Một protocol chuẩn đề ra do Fallon và cs dựa trên quy trình và khuyến cáo của Cioli ởCộng đồng châu Âu họp tại Leiden, Hà Lan rằng tiêu chuẩn hóa có giá trị nhưng mô hình chuột vẫn rất khó để thảo luận, nghiên cứu và phiên giải kết quả sau này. -Yêu cầu quan trọng trong in vitro test. Là sán máng trưởng thành có thể nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, tạo ra cơ hội tuyệt vời để làm rõ trong phơi nhiễm in vitro với sán riêng lẽ. Những thử nghiệm như thế sẽ chính xác hơn nhiều, khả năng sinh sản hơn nhiều và có khả thi hơn mô hình thực nghiệm, cho phép sàng lọc một số lượng lớn sán cũng như xác định các phân lậpđạt yêu cầu. Điều này cho phép nghiên cứu sâu về kháng hycanthone và oxamniquine. Tuy nhiên, đối với PZQ thử nghiệm không thể thiết lập với điều kiện là không có dòng tham khảo kháng thuốc đáng tin cậy. -Do vậy, ưu tiên trong nghiên cứu KTGS ở sán máng và sán dây ở người để tiến hành nghiên cứu trên thực địa cộng đồng nơi mà những nghi ngờ về lâm sàng hoặc khía cạnh dịch tễ học phải được đầu tư, nhằm phân lập nhiều cá thể KST từ những bệnh nhân không được chữa khỏi và xác định kết quả trên mô hình thực nghiệm. Một khi những dòng như thế được thiết lập và củng cố thì test in vitro có thể hợp lệ. Từ đó, cho phép thử nhanh trên thực địa nhằm phân lập và nghiên cứu sâu về sinh học cũng như di truyền trong KTGS ở người. Kết luận Các báo cáo gần đây cho thấy xuất hiện kháng thuốc nổi lên ở các loại ký sinh trùng giun tròn ở người, đặc biệt là giun móc/ mỏ, chưa cung cấp bằng chứng kết luận gia tăng các dòng dung nạp vốn có hoặc xuất hiện do các dòng đột biến mới. Tuy nhiên, người ta đề xuất những dòng kháng hoặc dung nạp đó có thể xuất hiện lại dưới áp lực thuốc (ví dụ giun móc ở Australia). Có lẽ, quan trọng hơn là các nghiên cứu đã chỉ ra các công cụ, phương pháp và trang thiết bị cũng như các bằng chứng đầy thuyết phục, giúp cảnh báo sớm một vấn đề y tế là KTGS sắp bị lãng quên hoặc chí ít cũng rút ra nhiều bài học quý giá về phòng KTGS. Một số từ viết tắt AR: Anthelmintic resistance (Kháng thuốc điều trị giun sán) FECRT: Fecal egg count reduction test (thử nghiệm phát hiện giảm trứng trong phân) HP: Homogeneous parasites (những ký sinh trùng dị hợp tử) EPGs: Eggs per gam (số lượng trứng trên một gam phân) WAAVP: World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (Hội KST thú y thế giới). ISG: Influx of susceptible genotypes (Dòng đi vào của kiểu gen ký sinh trùng nhạy cảm) ESG: Efflux of susceptible genotypes (Dòng đi ra của kiểu gen ký sinh trùng nhạy cảm) ERR: Egg reduction rate (Tỷ lệ giảm trứng trong phân) CR: Cure rate (tỷ lệ chữa khỏi)
|
TRANG CHỦ
