1. Bối cảnh dịch tễ
Trong lịch sử phòng chống sốt rét toàn cầu, sự chú ý vào nguồn lực y tế thường tập trung chủ yếu vào hai loài Plasmodium falciparum do tỷ lệ tử vong cao và Plasmodium vivax do đặc tính tái phát xa sau nhiều năm đã điều trị. Sự phân bổ này vô hình trung khiến các loài Plasmodium loại non-falciparum, đặc biệt là Plasmodium malariae, ít được quan tâm đúng mức trong hệ thống giám sát y tế. Tuy nhiên, các dữ liệu dịch tễ học và sinh học phân tử gần đây cho thấy P. malariae đóng góp một tỷ trọng đáng kể vào gánh nặng bệnh tật chung. Khả năng lẩn tránh miễn dịch, duy trì nhiễm trùng mạn tính kéo dài và sự hạn chế về độ nhạy của các xét nghiệm chẩn đoán nhanh (RDTs) tại tuyến cơ sở đã biến P. malariae thành một thách thức đáng kể đối với mục tiêu loại trừ sốt rét của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG). Bài viết này tập trung phân tích hiệu quả của các RDTs đối với chẩn đoán P. malariae dựa trên dữ liệu dịch tễ, sinh lý bệnh và sinh hóa, đồng thời đề xuất các hướng đi công nghệ mới nhằm khắc phục hạn chế trong chẩn đoán
2. Đặc điểm sinh học, chu kỳ sống và sinh lý bệnh của Plasmodium malariae
Đặc điểm sinh học và chu kỳ phát triển của P. malariae quyết định trực tiếp đến nồng độ các dấu ấn sinh học giải phóng vào dòng máu, từ đó chi phối ảnh hưởng lên hiệu quả chẩn đoán của xét nghiệm nhanh hiện nay trên thị trường.
2.1. Động lực học sinh sản tại gan và “ái tính”với tế bào hồng cầu
Chu kỳ sống của P. malariae ở người bắt đầu khi muỗi Anopheles spp. mang mầm bệnh chích và bơm/ đẩy thoa trùngvào máu vật chủ. Thoa trùng nhanh chóng di chuyển đến gan và xâm nhập vào các tế bào ganđể bắt đầu giai đoạn sinh sản vô tính ngoại hồng cầu. Ở giai đoạn này, điểm khác biệt cốt lõi đầu tiên của P. malariae so với các loài khác xuất hiện. Trong khi một tế bào gan bị nhiễm P. falciparum khi vỡ ra có thể giải phóng một lượng “khổng lồ” lên tới 40.000 mảnh trùng vào dòng máu và P. vivax giải phóng khoảng 10.000 mảnh trùng, thì P. malariae lại có hiệu suất sinh sản cực kỳ hạn chế. Mỗi tế bào gan bị nhiễm P. malariae chỉ giải phóng trung bình khoảng 2.000 mảnh trùng. Nguồnmảnh trùng ban đầu thấp tạo ra một sự khởi đầu rất chậm cho chu kỳ nhiễm trùng máu tiếp theo.
Bước vào giai đoạn hồng cầu, nếu như P. falciparum sở hữu bộ máy enzyme và thụ thể đa dạng cho phép nó xâm nhập vào mọi giai đoạn trưởng thành của tế bào hồng cầu, từ hồng cầu lưới non đến hồng cầu già và P. vivax cùng P. ovale ưu tiên xâm nhập các hồng cầu non (chiếm khoảng 1% tổng lượng hồng cầu lưu thông),thì P. malariae chỉ ưu tiên xâm nhập các hồng cầu đã già yếu. Đặc điểm sinh học này mang tính quyết định đến hình thái lâm sàng và chẩn đoán, bởi vì hồng cầu già chỉ chiếm một tỷ lệ vô cùng nhỏ, khoảng 0,1% tổng số lượng hồng cầu trong cơ thể người.
Do quần thể tế bào đích cực kỳ hạn chế, sự phát triển theo cấp số nhân của ký sinh trùng bị kìm hãm ở mức tối đa. Kết quả tất yếu là mật độ ký sinh trùngở các bệnh nhân nhiễm P.malariae luôn được duy trì ở ngưỡng cực kỳ thấp, thường xuyên rơi vào mức dưới ngưỡng vi thể, tức là không thể quan sát thấy ngay cả dưới kính hiển vi quang học thông thường.Ngoài ra, chu kỳ sinh sản vô tính trong hồng cầu của P. malariae kéo dài 72 giờ, dài nhất trong số loài gây bệnh ở người, nên biểu hiện lâm sàng với sốt cách hai ngày một lần, tốc độ phát triển chậm cũng góp phần làm giảm tải lượng kháng nguyên lưu hành trong máu.
2.2. Cơ chế tiềm ẩn kéo dài và trạng thái cân bằng miễn dịch
Đặc điểm sinh học đáng chú ý của P. malariae là khả năng duy trì nhiễm trùng tiềm ẩn kéo dài. Yvăn thế giới đã ghi nhận những trường hợp tái bùng phát bệnh sau thời gian ủ bệnh kéo dài tới 50 năm kể từ lần phơi nhiễm ban đầu. Đặc tính này thường bị nhầm lẫn với hiện tượng tái phát ở P. vivax và P. ovale. Tuy nhiên, nghiên cứu sinh học phân tử hiện đại đã chứng minh rằng P. malariae hoàn toàn không có “giai đoạn ngủ đông” tại gan, tức là không hình thành thể ngủ. Sự tồn tại dai dẳng của loài dựa trên một cơ chế hoàn toàn khác:Sự thiết lập một trạng thái cân bằng nội môi vi mô “tinh vi” giữa ký sinh trùng và hệ thống miễn dịch của vật chủ.
Trong trạng thái cân bằng này, P. malariae duy trì một quần thể ký sinh trùng cực nhỏ trong máu, vừa đủ để tồn tại sinh học và phát triển liên tục, nhưng lại nằm dưới ngưỡng có thể kích hoạt một phản ứng miễn dịch toàn thân, từ đó bệnh nhân hoàn toàn không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng. Khả năng lẩn trốn này một phần được hỗ trợ bởi ái tính với hồng cầu già, những tế bào vốn đang trên đà bị hệ thống thực bào (đặc biệt tại lách) dọn dẹp, tạo ra một màng bọc che giấu hoàn hảo.
Sự cân bằng mong manh này có thể tồn tại suốt đời vật chủ, nhưng cũng có thể bị phá vỡ bất cứ lúc nào bởi các sự kiện gây căng thẳng (stress) về mặt sinh lý hoặc các can thiệp y tế làm suy giảm chức năng miễn dịch. Các nghiên cứu đã chỉ ra những yếu tố kích hoạtkinh điển gây ra sự bùng phát trở lạicủa P. malariae, bao gồm các cuộc phẫu thuật lớn, quá trình cắt bỏ lách, liệu pháp điều trị bằng thuốc ức chế miễn dịch ở bệnh nhân ung thư hoặc cấy ghép tạng, sự xuất hiện bệnh lý đi kèm và quá trình suy giảm của hệ thống miễn dịchở người cao tuổi.
Khi trạng thái cân bằng bị phá vỡ, mật độ ký sinh trùng ở máu vượt qua ngưỡng kiểm soát, bệnh nhân sẽ đột ngột khởi phát các triệu chứng sốt rét cấp tính dù không hề có tiền sử di chuyển đến các vùng dịch tễ học lưu hành bệnh trong nhiều năm qua, gây ra sự hoang mang tột độ cho các bác sĩ lâm sàng và dẫn đến những chẩn đoán sai lệch nghiêm trọng.
2.3. Hậu quả lâm sàng của việc bỏ sót chẩn đoán
Nhiễm trùng mạn tính P. malariae khôngđược chẩn đoán và điều trị có thể dẫn đến các hệ lụy lâm sàng thông qua cơ chế miễn dịch bệnh lý. Khác với các cơn bão cytokine cấp tính do P. falciparum gây ra, tổn thương do P. malariae mang tính chất tích lũy, mạn tính và phá huỷ dần dần các hệ cơ quan thông qua cơ chế miễn dịch bệnh lý. Hậu quả lâm sàng nghiêm trọng nhất liên quan đến nhiễm trùng P. malariae dai dẳng là “hội chứng thận hư do sốt rét”. Cơ chế sinh bệnh học của tình trạng này không phải do ký sinh trùng trực tiếp phá hủy nhu mô thận, mà do sự hình thành liên tục và lắng đọng của các “phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể” tại màng đáy cầu thận trong suốt quá trình nhiễm trùng mạn tính. Sự lắng đọng kéo dài này kích hoạt chuỗi phản ứng viêm cầu thận mạn tính, dẫn đến protein niệu nghiêm trọng, phù nề toàn thân, suy giảm độ lọc cầu thận và cuối cùng tiến triển thành suy thận mạn tính không thể đảo ngược, đặc biệt phổ biến ở nhóm bệnh nhi tại vùng dịch tễ Châu Phi.
Bên cạnh tổn thương thận, nhiễm trùng tiềm ẩn còn gây ra tình trạng thiếu máu dai dẳng do quá trình tiêu hủy hồng cầu liên tục với cường độ thấp kết hợp với sự ức chế tủy xương mạn tính, dẫn đến giảm sút chất lượng sống nghiêm trọng và gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh lý cơ hội khác. Hơn thế nữa, trong các đợt bùng phát cấp tính, P. malariae vẫn hoàn toàn có khả năng gây ra các hội chứng sốt rét ác tính (SRAT). Ghi nhận thực tế từ đợt dịch lớn tại huyệnKhánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà năm 2023-2025 cho thấy, mặc dù phần lớn các ca bệnh có triệu chứng cơ bản (sốt, ớn lạnh, đổ mồ hôi, đau đầu, mệt mỏi, đau cơ), vẫn có tới 1,8% đến 4,2% số ca sốt rét thường chuyển biến thành SRAT với các biểu hiện lâm sàng như thiếu máu cục bộ nặng, giảm tiểu cầu mức độ nguy hiểm, lơ mơ, mất ý thức (hôn mê) như SRAT thể não và suy đa tạng (MOF).
Các phương pháp chẩn đoán ưu tiên như RDTs không thể nhận diện được tác nhân gây bệnh nên sẽ tước đi cơ hội được tiếp cận sớm với các liệu pháp thuốc chống sốt rét đặc hiệu (như các liệu pháp phối hợp dựa trên thành phần chính Artemisinin-ACTs), để mặc cho bệnh lý tiến triển đến những giới hạn đe dọa sinh mệnh.
3. Cơ chế sinh hóa và nguyên nhân hạn chế của xét nghiệm nhanh chẩn đoán P.malariae
Kể từ khi triển khai rộng rãi vào đầu thế kỷ 21, xét nghiệm chẩn đoán nhanh (RDTs) đã tạo ra một cuộc cách mạng thực sự trong chiến lược quản lý bệnh sốt rét toàn cầu.
Với ưu điểm thiết kế gọn nhẹ, không yêu cầu nguồn điện, không cần đào tạo bài bản, dễ dàng bảo quản ở nhiệt độ phòng và cung cấp kết quả “trực quan” chỉ trong vòng 15 đến 20 phút mà không cần yêu cầu cao từ các kỹ thuật viên phòng xét nghiệm, các RDTs đã cho phép mở rộng khả năng tiếp cận chẩn đoán đến tận các vùng sâu, vùng xa, những nơi mà hệ thống y tế cơ sở (YTCS) còn nhiều thiếu thốn. Tuy nhiên, xét nghiệm này vốn được thiết kế và tối ưu hóa chủ yếu nhằm phục vụ cho mục tiêu kiểm soát P. falciparum.
Việc mở rộng ứng dụng RDTs sang mục đích phát hiện các loài non-falciparum như P. malariae đã bộc lộ những lỗ hổng nghiêm trọng trong thiết kế sinh hóa và miễn dịch học cơ bản của chúng.
3.1. Nguyên lý sắc ký miễn dịch dòng chảy
Về bản chất, phần lớn các bộRDTs chẩn đoán sốt rét thương mại hiện hành đều hoạt động dựa trên nguyên lý của sắc ký miễn dịch dòng chảy bên (lateral flow immunochromatography-LFIC). Khi một giọt máu toàn phần của bệnh nhân được nhỏ vào giếng mẫu cùng với dung dịch ly giải, các tế bào hồng cầu sẽ bị phá vỡ, giải phóng các kháng nguyên ký sinh trùng nội bào vào môi trường dịch thể. Hỗn hợp dịch này sẽ di chuyển dọc theo một dải màng nitrocellulose nhờ cơ chế mao dẫn. Dọc theo các màng, các nhà sản xuất đã cố định sẵn các dải kháng thể đơn dòng cực nhạy, được đánh dấu bằng các hạt nano vàng hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang.
Nếu trong máu có sự hiện diện của kháng nguyên tương ứng, chúng sẽ bị bắt giữ bởi các kháng thể này, tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể có khả năng hiển thị thành các vạch màu trực quan tại vùng đọc kết quả, đồng thời một vạch chứngsẽ xuất hiện để xác nhận dung dịch đã chảy qua màng thành công.Đểchẩn đoán, hiện nay đã có ít nhất ba đích kháng nguyênphổ biến được ứng dụng trong thiết kế RDTs:
- +HRP2 (Histidine-Rich Protein 2):Đây là một protein hòa tan trong nước được biểu hiện mạnh và giải phóng một lượng lớn vào dòng máu bệnh nhân. Tuy nhiên, kháng nguyên này chỉ đặc hiệu duy nhất cho loàiP. falciparum, hoàn toàn không hiệu quả đối với các loài khác;
- +pLDH (Plasmodium lactate dehydrogenase):Đây là một loại enzyme tham gia vào con đường chuyển hóa năng lượng đường phâncủa ký sinh trùng. Điểm đặc biệt của pLDH là nó được biểu hiện ở tất cả loàiPlasmodiumspp. gây bệnh ở người. Các nhà thiết kế có thể sử dụng các kháng thể nhận diện các epitope chung được bảo tồn trên phân tử pLDH của mọi loài (gọi là Pan-pLDH) để phát hiện sự có mặt của sốt rét nói chung, hoặc sử dụng các kháng thể nhận diện vùng đặc hiệu cấu trúc (như Pv-pLDH) để phát hiện P. vivax(Specific hay đặc hiệu cho loài đó).
- +Aldolase:Tương tự như pLDH, aldolase cũng là một enzyme chuyển hóa cơ bản được bảo tồn xuyên suốt sự tiến hóa của chiPlasmodiumspp., thường được ứng dụng làm dấu ấn chẩn đoán chung cho các loài sốt rét (Pan-aldolase).
Vì P. malariae không sản xuất ra protein HRP2, do đó sự phát hiện loài ký sinh trùng này qua RDTs phải dựa hoàn toàn vào khả năng liên kết chéo của các kháng thể pan-pLDH hoặc pan-aldolase có mặt trên khay thử.
Hình 1. Các loại xét nghiệm chẩn đoán nhanh sử dụng các đích kháng phổi biến
3.2. Cơ sở sinh hóa của hiện tượng âm tính giả trongchẩn đoán ởP. malariae
Thực tế kiểm nghiệm thực địa và đối chiếu phân tử đã chỉ ra tỷ lệ âm tính giảcực kỳ cao khi sử dụng RDTs để phát hiện các ca nhiễm P. malariae. Sự thất bại mang tính cấu trúc này xuất phát từ sự tương tác bất lợi của ba yếu tố sinh học và hóa sinh sau đây:
+ Thứ nhất, giới hạn mật độ kháng nguyên: Như đã phân tích về đặc tính sinh học lây nhiễm ưa xâm nhập các hồng cầu già, P. malariae tạo ra tải lượng ký sinh trùng trong máu ở mức cực kỳ thấp. Ngưỡng phát hiện giới hạncủa phần lớn các dòng RDTs pan-pLDH lưu hành trên thị trường dao động từ 100 đến 1.000 ký sinh trùng/µL máu. Trong khi đó, mật độ ký sinh trùng ở những bệnh nhân nhiễm P. malariae mạn tính không triệu chứng thườngở mức dưới ngưỡng này rất xa (thậm chí chỉ ở mức <10 ký sinh trùng/µL). Sự thiếu hụt trầm trọng về mặt số lượng protein pLDH hoặc aldolase được giải phóng ra máu khiến các phân tử này không đủ nồng độ để tạo ra một dải phức hợp kháng nguyên-kháng thể đủ lớn để có thể quan sát thấy vạch màu bằng mắt thường trên khay giấy nitrocellulose ở RDTs.
+ Thứ hai, đặc thù biến đổi đa hình cấu trúc protein: Các kháng thể đơn dòng pan-pLDH và pan-aldolase sử dụng trong RDTs trên thực tế được thiết kế, phân lập và tối ưu hóa ái lực liên kết dựa trên mô hình cấu trúc phân tử của P. falciparum và P. vivax. Mặc dù pLDH là một enzyme bảo tồn cao, các nghiên cứu giải trình tự gen đã chỉ ra sự tồn tại các đa hình nucleotide đơn (SNPs) trên gen mã hóa pLDH của P. malariae, dẫn đến những thay đổi nhỏ nhưng then chốt trong cấu trúc không gian ba chiều của các epitope trên bề mặt enzyme.
Sự biến đổi cấu trúc nàylàm suy giảm đáng kể ái lực liên kếtgiữa các kháng thể đơn dòng trong RDTs và phân tử pLDH của P. malariae. Do lực bám dính yếu, phức hợp miễn dịch khó được hình thành bền vững trên màng sắc ký, làm trầm trọng thêm vấn đề âm tính giả vốn đã bị ảnh hưởng bởi nồng độ kháng nguyên thấp.
+ Thứ ba, sự cạnh tranh gắn kết trong các ca đồng nhiễm: Môi trường dịch tễ thực tế tại các vùng lưu hành cao, nhưcận Sahara của châu Phi, ghi nhận một tỷ lệ rất lớn các bệnh nhân nhiễm phối hợpgiữa P. falciparum và P. malariae. Khi sử dụng RDTs tích hợp phát hiện đồng thời HRP2 (cho P. falciparum ) và pan-pLDH (cho non-falciparum), một nồng độ pLDH lớn sinh ra từ quần thể P. falciparum phát triển nhanh chóng sẽ ngay lập tức chiếm giữ toàn bộ các vị trí gắn kết của kháng thể pan-pLDH trên khay thử của RDTs. Sự lấn át sinh hóa này hoàn toàn che lấp đi tín hiệu yếu ớt từ pLDH của P. malariae, khiến kết quả chẩn đoán hiển thị ra chỉ là nhiễm P. falciparum đơn thuần, dẫn đến việc P. malariae tiếp tục bị bỏ qua trong phác đồ quản lý theo dõi điều trị sau đó.
(Còn nữa) --> Tiếp theo Phần 2
Ths.BS. Nguyễn Công Trung Dũng & TS.BS. Huỳnh Hồng Quang
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn