Qua thực tiến lâm sàng và điều trị cho thấy nhiều tuyến điều trị khi nhận được kết quả phát hiện và chẩn đoán sốt rét bằng lam máu nhuộm giêm sa đều chỉ trả lời là P.falciparum hay P. vivax hay nhiễm phối hợp (P. falciparum + P. vivax), với các mật độ biểu hiện dưới dạng dấu cộng mà thôi, chứ hầu hết (> 95%) trong số đó không hề trả lời kết quả dưới dạng mật độ MĐKSTSR/ mL máu.
Song, điều quan trọng là khi trả lời mật độ ký sinh trùng sốt rét không những giúp đánh giá tình trạng nặng ban đầu của bệnh nhân trước khi điều trị, mà sau đó còn giúp cho các nhà điều trị theo dõi cũng như tiên lượng bệnh nhân một cách thấu đáo các ca bệnh có nguy cơ đe dọa sốt rét ác tính (SRAT) hoặc sốt rét nặng, thậm chí có nguy cơ tử vong. Sau khi điều tra tìm hiểu lý do tại sao các xét nghiệm viên hiếm khi hoặc không bao giờ thực hiện khâu đếm mật độ KSTSR theo trên 1 microlits là:
[1] do họ chỉ học và được tập huấn có thời gian ngắn tại huyện, tại tỉnh hoặc tại Viện nên không thể đủ làm được,
[2] do không có đủ trang thiết bị để đếm và tài liệu để thực hành,
[3] do cơ sở và các bác sĩ không yêu cầu đếm nên không đếm mật độ KSTSR, nên một thời gian dài họ cho qua luôn va coi đó là bị lãng quên.
Nhằm giúp cho các cán bộ xét nghiệm bổ sung kiến thức và nắm bắt kỹ năng và kỹ thuật đếm KSTSR hỗ trợ cho hệ điều trị tốt hơn trong thời gian đến, chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật và kỹ năng đếm MĐKSTSR theo phượng pháp của Mạng lưới sốt rét ACT malaria và Tổ chức Y tế thế giới. Hiện có 2 phương pháp định lượng:
1. Phương pháp dùng hệ thống dấu cộng:
Đếm KSTSR trong 1 vi trường hoặc 100 vi trường.
- Soi 100 vi trường có 1 – 10 KSTSR: Kết luận+
- Soi 100 vi trường có 11 – 100 KSTSR: Kết luận++
- Soi 1 vi trường có 1 – 10 KSTSR: Kết luận+++
- Soi 1 vi trường có trên 10 KSTSR: Kết luận++++
- ( + ) : mật độ rất thấp, phải soi kỹ mới phát hiện được.
Phương pháp này đơn giản, nhanh, độ tin cậy tương đối nhưng không chính xác vì xét nghiệm viên chỉ ước đoán và không lượng hóa được KST cần biết. Do đó phải đếm KSTSR trên số bạch cầu trên 1 vi trường và áp dụng theo công thức tính mật độ KSTSR/mm3máu đã quy định.
2. !important; Phương pháp tính mật độ KSTSR/mm3máu (Dựa vào số lượng bạch cầu chuẩn 8.000 BC hay 6.000 BC).
- Đếm mật độ KSTSR rất quan trọng, nhất là các trường hợp nhiễm sốt rét do P.falciparum (mật độ P.falciparum >100.000/µl máu, tỷ lệ hồng cầu nhiễm > 5% và có thể phân liệt trong máu là một trong những tiêu chuẩn chẩn đoán sốt rét nặng hiện nay) giúp cho các thầy thuốc lâm sàng chẩn đoán và tiên lượng bệnh tốt hơn.
- Theo dõi được diễn biến số lượng KSTST hàng ngày trong quá trình điều trị, trong các thử nghiệm in vivo đánh giá KSTSR kháng thuốc, đánh giá hiệu lực phác đồ…
- Hiện nay, ở nước ta nói chung và khu vực miền Trung – Tây Nguyên nói riêng thì việc đếm KSTSR chỉ khu trú trong công tác nghiên cứu ở các Viện, bệnh viện Trung ương, bệnh viện Tỉnh còn hầu hết các tuyến điều trị từ huyện đến xã vẫn ước lượng KST theo hệ thống dấu cộng cho nên chủ trương phổ cập kỹ thuật đếm cho các kỹ thuật viên ở các trung tâm xét nghiệm và điểm KHV là hết sức cần thiết và quan trọng.
- Tiêu chuẩn một vi trường tốt phải có 15 – 20 bạch cầu, nếu vi trường chỉ có 10 bạch cầu thì quá mỏng, nếu vi trường tới 40 BC thì quá dày. Để tạo 1 vi trường tốt ngoài kỹ thuật làm giọt máu đặc còn liên quan đến độ phóng đại của KHV.
- Thực tế với độ phóng đại 1.000x có từ 12 – 15 BC là tiêu bản tốt. Như vậy, với 100 vi trường lý tưởng ta có 2.000 BC nhưng để đếm tới 2.000BC thì phức tạp, tốn thời gian nên chỉ cần đếm theo 200, 500 hay 1.000BC.
- Trước khi đếm, cần xét nghiệm khoảng 0,25µl máu (khoảng 100 vi trường, sử dụng thị kính số 7 và vật kính dầu 100) trên lam giọt dày để xác định loài ký KSTSR và các giai đoạn phát triển của KSTSR.
- Khi đã làm xong, các bước trên, tiến hành đếm KSTSR trên lam giọt dày như sau:
1. Cần có 2 máy đếm để đếm KSTSR và BC riêng rẽ.
- Nếu sau khi đếm được 200 BC mà số lượng KSTSR > 10 thì áp dụng công thức:
- Nếu sau khi đếm được 200 BC mà số lượng KSTSR < 10 thì tiếp tục đếm cho đủ 500 BC hoặc 1.000 BC rồi áp dụng công thức để tính số KSTSR/µl.
- Trường hợp mật độ KSTSR trên lam nhiều: Đếm chưa đủ 200 BC mà số lượng KSTSR ≥ 500 thì ta không đếm tiếp mà áp dụng công thức trên.
Ví dụ:
a. !important; KSTSR P. falciparum và bạch cầu đếm được: 10 KSTSR/200 BC, áp dụng công thức trên:
b. !important; KSTSR P. falciparum và bạch cầu đếm được: 9 KSTSR/500 BC, áp dụng công thức trên:
c. !important; Trường hợp KSTSR P. falciparum mật độ cao, đếm KSTSR đến 500 thì dừng lại, áp dụng công thức.
Ví dụ: đếm được 550 KSTSR và BC là 43 ( 510 / 43 BC)
Cách trả lời kết quả xét nghiệm với các kết quả đếm trên:
- a, KSTSR: P.FT+ = 400 / µl
- b, KSTSR: P.FT+ = 144 / µl.
- c, KSTSR: P.FT++++= 102.102/ µl
Trường hợp bệnh nhân bị nhiễm vừa thể vô tính, vừa thể hữu tính (giao bào - Gametocyte), lấy trường hợp thứ 3 (c) làm ví dụ, nếu có thêm giao bào thì ghi kết quả như sau:
- KSTSR: P.FT ++++ = 102.235/ µl
P.FT ++++G+
- Người ta sẽ hiểu: Bệnh nhân có nhiễm thể giao bào (gametocyte (G)) nhưng không đếm, mà chỉ đánh giá mật độ (G) theo hệ thống dấu cộng (+), có nghĩa là 102.235 KSTSR chỉ có thể tư dưỡng (Trophozoite).
- Một lam máu được coi là âm tính khi kiểm tra 1.000 bạch cầu mà không có một ký sinh trùng vô tính nào.
- Trong trường hợp có nghi ngờ nhiễm phối hợp, lam giọt mỏng sẽ được kiểm tra để xác định.
· !important; Cách đếm:
- Sau khi phát hiện KST ta sẽ chọn điểm phía trên cùng của giọt máu dù không thấy bạch cầu và đếm.
- Các lam máu tùy theo kỹ thuật làm của kỹ thuật viên mà sẽ không giống nhau, chỗ dày, mỏng, nhạt, đậm cho nên kết quả đếm sẽ không giống nhau.
- Không nên đếm các vi trường gần nhau, nên đếm có khoảng cách từ 3 – 5 vi trường.
- Có thể bỏ qua những vi trường xấu, bẩn hoặc quá dày.
· !important; Nên tránh:
- Các bạch cầu nằm ở rìa mà phần bạch cầu nhìn thấy rõ trong vi trường thì đếm. Các bạch cầu nằm ở rìa mà không thể kết luận là bạch cầu thì không nên đếm. Nên đếm bắt đầu từ mũi 12h theo chiều kim đồng hồ và lần lượt đếm hết vi trường là chính xác nhất.
- Một vấn đề nữa, không thể bỏ qua, khi đếm KSTSR, khi mật độ 1+, 2++ thì đếm dễ dàng, nhưng từ 3+ trở lên hoặc KSTSR dày đặc vi trường (như bánh tráng rắc mè) thì đếm làm sao đây? Kinh nghiệm của chúng tôi, cải tiến buồng đếm như sau: lấy lam kính mới mỏng tốt, cắt vừa vặn, dài bằng đường kính vòng cao su có sẵn trên đầu thị kính,kẻ ca-rô bằng bút viết kính, thưa dày tùy theo mình thích như buồng đếm HC – BC, sau đó nhẹ nhàng luồn vào trong vòng cao su để đếm. Khi không cần thiết, lấy ra cất. Hiện tại, trên thương trường các hãng sản xuất kính hiển vi, có thể bán buồng đếm này, nhưng khó mua, do mua số lượng ít!
Việc đếm mật độ KSTSR, không những có giá trị thật sự quan trọng về mặt điều trị và theo dõi bệnh nhân trên lâm sàng mà chúng còn có giá trình trong nghiên cứu đánh giá các hiệu lực phác đồ thuốc sốt rét theo quy trình 28 ngày hoặc 42 ngày, để phân tích nhạy kháng và thất bại điều trị sau khi sử dụng một số phác đồ. Ngoài ra, các chiến lược đang loại trừ sốt rét có những tiêu chí còn lệ thuộc vào chỉ số KSTSR nên khi đó vai trò đếm MĐKSTSR còn có ý nghĩa hơn rất nhiều.
Tài liệu tham khảo:
1. http: //www.dpd.cdc.gov/dpdx/htm/imagelibrary/malaria.htm
2. WHO (1991). Basic Malaria microscopy (Part 1 and Part 2)
3. WHO (2010). Basic malaria microscopy (Learner guides)