Tính toán kích thước mẫu chính xác là
điều thiết yếu để đảm bảo đối xử có đạo đức với nghiên cứu trên động vật và mô
hình động vật và thu được kết quả khoa học đáng tin cậy, tuân thủ nguyên tắc phổ
biến 3R (Giảm thiểu, Tinh chỉnh, Thay thế) và sau này có các nguyên tắc R bổ
sung hay sửa đổi khác (supplement or modified R principle). Các yếu tố chính
trong việc xác định kích thước mẫu bao gồm cỡ hiệu ứng, tỷ lệ lỗi loại I (α) và
độ mạnh (1-β). Các nghiên cứu có độ mạnh thấp có thể dẫn đến kết quả không rõ
ràng, cỡ hiệu ứng bị thổi phồng và khả năng tái lập kém, làm suy yếu tiến bộ
khoa học và các tiêu chuẩn đạo đức trong nghiên cứu, nhất là các nghiên cứu thử
nghiệm lâm sàng. Các nghiên cứu thiếu tính hiệu quả, không bao gồm đủ số lượng
động vật thí nghiệm, có thể tạo ra kết quả không rõ ràng hoặc gây hiểu nhầm,
không thúc đẩy tiến bộ khoa học hoặc khả năng tái lập kết quả nghiên cứu. Do
đó, các nghiên cứu thiếu tính hiệu quả đã gây ra tình trạng thí nghiệm trên
động vật không cần thiết và vi phạm nguyên tắc 3R.
Tính toán cỡ mẫu chính xác là một yêu
cầu bắt buộc cả về mặt khoa học và đạo đức trong nghiên cứu y sinh học
(biomedical ethics). Các nhà nghiên cứu thường xuyên được yêu cầu giải thích số
lượng động vật được sử dụng trong các nghiên cứu bởi các cơ quan quản lý hay
các tổ chức tài trợ hoặc ngày càng nhiều hơn - bởi các biên tập viên tạp chí
khi phản biện các kết quả nghiên cứu. Phù hợp với nguyên tắc 3R, các nghiên cứu
nên được thiết kế để giảm số lượng động vật được sử dụng mà vẫn đáp ứng được
các mục tiêu khoa học. Mặc dù những lý do đạo đức đằng sau việc giảm số lượng
thí nghiệm là hiển nhiên, nhưng việc kiểm nghiệm nghiêm ngặt các giả thuyết thí
nghiệm khi kết quả có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người cũng rất
quan trọng về mặt đạo đức.
Tính toán công suất và cỡ mẫu
Đảm bảo thí nghiệm sử dụng cỡ mẫu đủ
lớn để đảm bảo tính khả thi là một khía cạnh quan trọng của thiết kế thí nghiệm/
thử nghiệm. Công suất, hay khả năng phát hiện sự khác biệt đáng tin cậy giữa
các nhóm thí nghiệm/ thử nghiệm, phụ thuộc vào một số yếu tố liên quan.
Kích thước mẫu (n): Số lượng đối
tượng trong mỗi nhóm thí nghiệm/thử nghiệm. Kích thước hiệu ứng là độ lớn của
sự khác biệt giữa các nhóm (bao gồm cả phương sai của dữ liệu, nếu có). α: Xác
suất của kết quả dương tính giả (lỗi loại I bác bỏ sai giả thuyết Null), thường
được đặt ở mức 0,05. β: xác suất của kết quả âm tính giả (lỗi loại II ủng hộ sai
giả thuyết Null), thường được đặt ở mức 0,2-0,1. Độ mạnh (1-β): Liên quan đến
xác suất của ngưỡng phát hiện dương tính thật (bác bỏ chính xác giả thuyết Null)
thường được đặt ở mức 0,8 - 0,9.
Nếu biết kích thước hiệu ứng, có
nhiều phương pháp có thể được sử dụng để tính toán kích thước mẫu phù hợp cho
mức độ α và độ mạnh mong muốn. Có thể sử dụng nhiều công cụ tính toán trực
tuyến và phần mềm để thực hiện các tính toán này. Việc xem xét chi tiết chủ đề
này nằm ngoài phạm vi bài viết này và các nhà nghiên cứu được khuyến khích tham
khảo ý kiến của chuyên gia thống kê. Tuy nhiên, có một số yếu tố quan trọng
cần được xem xét.
Kích thước hiệu ứng
Kích thước hiệu ứng thực tế trong một
thí nghiệm/thử nghiệm hiếm khi được biết trước, và phương sai trong dữ liệu
cũng vậy. Chúng thường là các giá trị ước tính dựa trên dữ liệu từ các nghiên
cứu trước đó hoặc nghiên cứu thử nghiệm thí điểm (pilot), có thể phản ánh hoặc
không phản ánh kết quả của một thí nghiệm/ thử nghiệm được đề xuất. Khi xác
định kích thước hiệu ứng này để tính toán cỡ mẫu, điều quan trọng là giá trị
này phải được đặt ở mức thấp hơn trong phạm vi được coi là có ý nghĩa khoa học.
Vì điều này xác định sự khác biệt tối thiểu có thể được phát hiện một cách đáng
tin cậy với kích thước mẫu đó. Ví dụ, nếu kích thước mẫu được tính toán để phát
hiện sự khác biệt là 2 độ lệch chuẩn, thì giá trị (n) này sẽ không đủ để phát
hiện bất kỳ hiệu ứng nào nhỏ hơn giá trị này một cách đáng tin cậy.
α và Độ mạnh
Một yếu tố quan trọng thứ hai là xác
định mức độ phù hợp cho α và độ mạnh (1-β). Đối với người không chuyên về thống
kê, những giá trị này thường dễ gây nhầm lẫn.
Tỷ lệ sai lầm loại I (α) dễ hiểu nhất,
đây là tỷ lệ dương tính giả (false positive) và tương ứng với giá trị p mong
muốn trong kiểm định giả thuyết thống kê. Giá trị α 'tiêu chuẩn' là 0,05 phản
ánh xác suất 1/20 rằng sự khác biệt được phát hiện giữa các nhóm không có thật
(tức là chỉ xảy ra do ngẫu nhiên). Do đó, giá trị α hoặc (p) có thể dễ bị hiểu
sai, chúng chỉ hỗ trợ chứ không thể chứng minh rằng hai nhóm khác nhau và dễ bị
ảnh hưởng bởi sự thiên vị.
Giả sử có 20 nhóm nghiên cứu trên
toàn thế giới đang kiểm tra cùng một giả thuyết: Thuốc A gây ra Tác dụng B. Ở
mức α = 0,05, có khả năng cao là một trong những nhóm này sẽ đưa ra dữ liệu cho
thấy Thuốc A thực sự gây ra Tác dụng B, ngay cả khi điều này trên thực tế không
đúng. Vì các kết quả tích cực dễ được công bố hơn các kết quả tiêu cực (tức là
thiên lệch trong việc báo cáo), nên tác dụng này có thể được báo cáo là có thật
trong tình huống giả định này (ngay cả khi 19 nhóm khác không nghĩ vậy). Thực
tế thống kê này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tái lập các nghiên cứu và báo
cáo kết quả tiêu cực. Hơn nữa, có một số người cho rằng giá trị p = 0,01 hoặc
thấp hơn có thể phù hợp hơn so với tiêu chuẩn 0,05.
Độ mạnh một thí nghiệm (1-β) có liên
quan nhưng độc lập với α, nó xấp xỉ tương ứng với xác suất phát hiện ra kết quả
là dương tính thật (bác bỏ giả thuyết Null khi giả thuyết thay thế là đúng).
Một thí nghiệm có độ mạnh cao hơn sẽ có cơ hội phát hiện ra hiệu ứng cao hơn
nếu hiệu ứng đó tồn tại. Nói chung, mức độ mạnh được đặt ở mức 0,8 trở lên, với
các thí nghiệm có rủi ro cao thường sử dụng mức độ mạnh cao hơn (ví dụ: đối với
các nghiên cứu độc chất học, trong đó việc có độ mạnh cao là rất quan trọng để
có độ tin cậy cao trong việc phát hiện các hiệu ứng.
Hậu quả của các thí nghiệm thiếu công suất
Các nghiên cứu có mức độ sức mạnh
thống kê thấp rất phổ biến trong khoa học sinh học. Một số bài tổng quan tài
liệu đã nhấn mạnh vấn đề này, cho thấy nhiều nghiên cứu sử dụng mức độ sức mạnh
thống kê thấp hơn nhiều so với mức “tiêu chuẩn” 0,8. Đây là một vấn đề đặc biệt
nổi tiếng trong lĩnh vực khoa học thần kinh, trong đó các nghiên cứu được công
bố cho thấy các hiệu ứng có ý nghĩa thống kê thường có mức độ sức mạnh thống kê
thấp tới 0,2.
Tại sao đây lại là vấn đề? Các nghiên
cứu có công suất thấp có khả năng không phát hiện ra hiệu ứng cao hơn nhiều
(khả năng âm tính giả cao hơn), nhưng nếu chúng phát hiện ra hiệu ứng, thì
những kết luận đó vẫn có giá trị chứ? Vì α không phụ thuộc vào công suất, nên
một nghiên cứu có công suất thấp vẫn có thể có khả năng kết luận dương tính giả
tương đối nhỏ. Tuy nhiên, có một số vấn đề với nhận định (về mặt kỹ thuật là
đúng) này. Các nghiên cứu với cỡ mẫu nhỏ thường đưa ra ước tính phóng đại về
kích thước hiệu ứng thực tế, điều này có thể dẫn đến kết luận sai lệch về ý
nghĩa thống kê. Giá trị dự đoán dương (PPV) hiếm khi được xem xét trong khoa
học sinh học thực nghiệm. Không giống như tỷ lệ dương tính giả (α), giá trị dự
doán dương tính là một thống kê cho biết mức độ khả năng một kết quả dương tính
là dương tính thật và có liên quan đến cả α và độ mạnh (1-β).
Một thí nghiệm có mức α rất nghiêm
ngặt nhưng sử dụng công suất thấp sẽ có giá trị dự đoán dương thấp (khả năng
phát hiện kết quả dương tính thực sự thấp hơn). Hậu quả của việc thực hiện các
nghiên cứu với giá trị dự đoán dương thấp là những phát hiện này có thể không
thể tái lập hoặc khái quát hóa cho toàn bộ quần thể (cả chuột và người).
Độ mạnh và khả năng tái lập của thí nghiệm
Các ngành khoa học sinh học đã bị chỉ
trích vì thiếu tính khả năng tái lập và dự đoán và việc sử dụng phổ biến các
nghiên cứu có cỡ mẫu nhỏ là một trong những nguyên nhân chính gây ra vấn đề
này. Bằng cách tăng cường độ mạnh của các nghiên cứu, cộng đồng khoa học có thể
tin tưởng hơn vào các kết quả đã công bố. Tất nhiên, điều này khác biệt với
nhiều nguồn sai lệch tồn tại trong quá trình thực hiện và báo cáo các nghiên
cứu khoa học. Tuy nhiên, hiện đang có một nỗ lực lớn nhằm đảm bảo rằng các
nghiên cứu trên động vật có “đủ sức mạnh thống kê” để tạo ra kết quả đáng tin
cậy và có khả năng dự đoán.
Tăng cường hiệu quả của các thí
nghiệm trên động vật: Tính toán cỡ mẫu dựa trên kích thước hiệu ứng tối thiểu
có ý nghĩa khoa học, với mức α và độ mạnh phù hợp và đảm bảo kết hợp cỡ mẫu này
vào các thí nghiệm. Kích thước mẫu nên dựa trên phân tích thống kê chứ không
phải sự tiện lợi (ví dụ: mật độ chuồng nuôi, kích thước lứa đẻ) hoặc chi phí
(chi phí động vật, chi phí nhân công). Báo cáo lý do lựa chọn kích thước mẫu,
bao gồm chi tiết về tính toán công suất, theo Hướng dẫn Nghiên cứu trên động
vật: Báo cáo những thí nghiệm trên cơ thể sống (ARRIVE - Animal Research: Reporting
of In Vivo Experiments) được tạo ra bởi NC3Rs (Trung tâm Quốc gia về Thay thế,
Cải tiến và Giảm thiểu việc sử dụng động vật trong nghiên cứu). Tính đến tỷ lệ
hao hụt động vật trong suốt thời gian nghiên cứu khi thiết lập kích thước mẫu.
Tăng kích thước hiệu ứng để tăng công suất với số lượng đối tượng ít hơn.
Các nguyên tắc dành cho nghiên
cứu trên động vật là gì?
Các
hướng dẫn về nghiên cứu trên động vật được xây dựng dựa trên khuôn khổ đạo đức
cơ bản của 03 nguyên tắc R: Thay
thế (sử
dụng các lựa chọn thay thế không phải động vật khi có thể, Nên sử dụng nuôi cấy tế bào, mô hình máy
tính hoặc mô phỏng máy tính thay vì động vật sống bất cứ khi nào có thể), Giảm
thiểu (sử dụng số lượng động vật ít nhất cần thiết, Thiết kế các nghiên cứu để đạt được kết
quả có ý nghĩa thống kê với số lượng động vật tối thiểu) và Cải
tiến (giảm thiểu đau đớn và khó chịu, Điều chỉnh điều kiện nuôi nhốt, thao tác và quy trình thí
nghiệm để giảm đau đớn, khó chịu và căng thẳng).
Việc
giám sát được thực thi trên toàn cầu thông qua các ủy ban thể chế, các tiêu
chuẩn pháp lý và các quy trình báo cáo tối ưu hóa các quy trình thí nghiệm để tối đa hóa sự khác
biệt giữa nhóm thí nghiệm và nhóm đối chứng, nếu điều này hợp lý về mặt đạo đức
và khoa học. Ví dụ: Chọn nền tảng chuột thuần chủng phù hợp/tối ưu, phản ứng
tốt nhất trong mô hình dự định. Giảm sự biến đổi trong thí nghiệm để tăng hiệu
quả với số lượng đối tượng ít hơn: Đảm bảo rằng các dòng chuột thuần chủng và
chuột biến đổi gen (GEM) có nền tảng di truyền chất lượng cao.
Giám sát và đánh giá thể chế
- Phê duyệt của IACUC: Tại Mỹ, các
cơ sở nghiên cứu phải có Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật (IACUC)
để xem xét và phê duyệt tất cả các quy trình thí nghiệm trên động vật trước khi
bắt đầu thí nghiệm;
- Thành phần Ủy ban IACUC: Các ủy ban
IACUC phải gồm một bác sĩ thú y, một nhà khoa học đang hành nghề và một thành
viên cộng đồng không liên kết với tổ chức.
- Giám sát liên tục: Các ủy ban
tiến hành kiểm tra định kỳ hai lần một năm các cơ sở và đánh giá quy trình để
đảm bảo tuân thủ liên tục.
Tiêu chuẩn pháp lý và quy định
- Đạo luật Phúc lợi Động vật (AWA): Luật liên
bang Hoa Kỳ do Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) ban hành, quy định việc chăm sóc,
xử lý và nuôi nhốt các loài động vật một cách nhân đạo.
- Chính sách của PHS: Chính sách
của Cơ quan Y tế Công cộng về Chăm sóc Nhân đạo và Sử dụng Động vật Thí nghiệm
quy định đối với các tổ chức nhận tài trợ nghiên cứu từ liên bang.
- Hướng dẫn: Hướng dẫn
của Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia về Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thí nghiệm quy định các tiêu
chuẩn hoạt động về chuồng trại, chăm sóc thú y và vệ sinh.
Thiết kế và báo cáo thí nghiệm
- Điểm kết thúc nhân đạo: Các nhà
nghiên cứu phải thiết lập các tiêu chí chính xác để dừng thí nghiệm sớm hoặc
tiến hành an tử nhân đạo cho động vật nếu xảy ra đau đớn nghiêm trọng hoặc
không thể tránh khỏi.
- Nguyên tắc ARRIVE: Các nhà khoa
học sử dụng danh sách kiểm tra Nguyên tắc
ARRIVE để đảm bảo báo cáo minh bạch, toàn
diện về các thí nghiệm trên động
vật sống, hỗ trợ khả năng tái tạo kết quả khoa học.
Nhìn chung, cách
dễ nhất để tính cỡ mẫu trong nghiên cứu y sinh học trên động vật là sử dụng
phần mềm thống kê miễn phí như G Power,
kết hợp với quy tắc phương trình tài nguyên (RE-Resource Equation) hoặc áp dụng
các công thức so sánh trung bình/tỷ lệ cơ bản. Các phương pháp chính:
- Dùng phần mềm G Power: Nhập mức ý
nghĩa (alpha = 0,05), lực mẫu (Power = 0,8) và độ lớn hiệu ứng (effect size)
dựa trên tài liệu trước;
- Dùng quy tắc Resource Equation:
Tổng số động vật trừ đi tổng số nhóm phải nằm trong khoảng từ 10 đến 20 cho các
thí nghiệm định hướng/ sinh học cơ bản;
- Dùng công thức toán học: Áp dụng khi so sánh hai
nhóm độc lập dựa trên độ lệch chuẩn và chênh lệch kỳ vọng.
Các bước thực hiện:
+ Xác định mục tiêu: Thí nghiệm để làm gì (so sánh
thuốc, đo lường sinh hóa);
+ Chọn phép kiểm định thống kê: T-test, ANOVA hay
Mann-Whitney;
+ Nhập thông số vào phần mềm hoặc tính tay theo cỡ
hiệu ứng tối thiểu có ý nghĩa thực tiễn;
+ Cộng thêm 10-15% số lượng dự phòng hao hụt do động
vật chết hoặc tai biến trong quá trình thí nghiệm.
Tài liệu
tham khảo
1. PS: Power and Sample Size Calculation (Windows, free) -
Software package from Vanderbilt University for multiple types of power
analysis.
2. G*Power (Windows/OSX, free) - Multi-platform software
package from Universität Düsseldorf for comprehensive power analysis
calculations.
3. Sample Size Calculations - Description of sample size
calculations from the IACUC at Boston University, including an Excel template
for calculation based on means/standard deviations and proportions.
4. Nature
Collection: Statistics for Biologists.
5. Krzywinski
M, Altman N. Points of significance: Power and sample size. Nat Methods.
2013; 10:1139-1140.
6. Button KS,
Ioannidis JP, Mokrysz C, Nosek BA, Flint J, Robinson ES, Munafò MR. Power
failure: why small sample size undermines the reliability of
neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2013 May;14(5):365-76.
7. Dumas-Mallet
E, Button KS, Boraud T, Gonon F, Munafò MR. Low statistical power in biomedical
science: a review of three human research domains. R Soc Open
Sci. 2017 Feb 1;4(2):160254.
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang
Viện Sốt rét-KST-CT Quy
Nhơn