Vấn đề 1. Trong thực tế, nhiều bệnh nhân mang mẫu ký sinh trùng trưởng thành đến nhờ phân tích nhưng họ lỡ bảo quản mẫu bệnh phẩm ký sinh trùng này trong dung dịch Formalin thì liệu có chạy được phân tích PCR không? Cách khắc phục mẫu bệnh phẩm tối ưu nhất là gì?
Theo kinh nghiệm của các nhà cận lâm sàng, các mẫu bệnh phẩm lỡ bảo quản trong formalin vẫn có thể tách chiết DNA/RNA và chạy PCR thành công nếu áp dụng đúng kỹ thuật xử lý đảo ngược liên kết chéo (reversal of cross-linking) và tối ưu hóa mồi. Các bước khắc phục cụ thể như sau:
1. Rửa sạch formalin và loại bỏ paraffin (nếu đã đúc sáp)
Rửa mẫu: Nếu mẫu chỉ ngâm trong dung dịch formalin lỏng, cần lấy mô ra và rửa thật kỹ bằng dung dịch đệm PBS (Phosphate-Buffered Saline) hoặc nước muối sinh lý nhiều lần để loại bỏ hoàn toàn dư lượng formalin còn bám lại, vì formalin tồn dư sẽ ức chế mạnh enzyme Taq polymerase trong phản ứng PCR.
Tẩy xylene/ Ethanol: Nếu mẫu đã qua xử lý đúc khối sáp hay còn gọi là mẫu vật được cố định bằng formalin và nhúng trong paraffin (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded _FFPE), tiến hành cắt lát mỏng (khoảng 5-10 µm), dùng dung dịch xylene để hòa tan paraffin, sau đó rửa lại bằng ethanol tuyệt đối để thu hồi pellet mô sạch. Đây là một phương pháp tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm được sử dụng để bảo quản các mẫu mô phục vụ cho nghiên cứu mô bệnh học, chẩn đoán và y học
2. Phá vỡ liên kết chéo do Formalin (Cross-link Reversal)
Formalin tạo ra các liên kết chéo giữa protein và acid nucleic (DNA/RNA), làm acid nucleic bị đứt gãy và khó bắt cặp. Khắc phục bằng cách tăng thời gian và nhiệt độ ủ mẫu trong đệm có chứa Proteinase K ở nhiệt độ cao hơn bình thường (thường ở 55-56°C trong 1-3 giờ, sau đó tăng nhiệt độ lên 80°C-90°C trong 1–hoặc nhiều giờ tùy phác đồ) để phá vỡ các liên kết chéo protein - DNA/RNA.
3. Sử dụng bộ kit tách chiết chuyên dụng
Không dùng các phương pháp tách chiết thông thường cho mẫu còn tươi. Cần sử dụng các bộ kit thương mại được thiết kế riêng cho mẫu dã cố định formalin như QIAamp FFPE Tissue Kit hoặc RNeasy FFPE Kit. Các kit này tối ưu hóa khả năng thu hồi acid nucleic bị phân mảnh nhỏ.
4. Thiết kế và tối ưu hóa phản ứng PCR
Giảm kích thước đoạn nhân lên (Amplicon size): DNA từ mẫu ngâm formalin thường bị vụn nhỏ. Hãy thiết kế mồi PCR sao cho kích thước đoạn cần khuếch đại (amplicon) ngắn, tốt nhất là dưới 150-250 cặp base (bp). Các đoạn dài trên 300 bp rất dễ thất bại.
Tăng lượng DNA khuôn: Do hiệu suất thu hồi thấp và chất lượng khuôn (template) kém, cần tăng nồng độ DNA khuôn trong phản ứng PCR so với mẫu bình thường.
Vấn đề 2. Nếu đứng trước một trường hợp xét nghiệm có kết quả Toxoplasma gondii dương tính với kháng thể IgM, nhà lâm sàng cần làm gì để tối ưu hóa cách xử trí từng ca bệnh?
Thái độ xử trí khi đứng trước một bệnh nhân có kết quả xét nghiệm kháng thể IgM Toxoplasma gondii dương tính sẽ phụ thuộc quan trọng vào từng đối tượng (đặc biệt là phụ nữ mang thai hay người bình thường) và việc kết hợp với xét nghiệm kháng thể IgG hoặc xét nghiệm độ ái lực của IgG (IgG avidity). Chúng ta cần bàn luận từng bước như sau:
1. Xác định ý nghĩa kết quả kháng thể IgG và IgM
Kháng thể IgM có thể tồn tại rất lâu sau khi nhiễm trùng cũ Toxoplasma gondii hoặc do phản ứng chéo. Kháng thể IgM Toxoplasma gondii trong các xét nghiệm huyết thanh thường dễ gặp hiện tượng phản ứng chéo hoặc cho kết quả dương tính giả với yếu tố dạng thấp (RF-Rheumatoid Factor), các kháng thể tự nhiên (Natural antibodies) trong cơ thể, hoặc do sự kích thích miễn dịch từ các tác nhân virus khác; Các virus trong nhóm TORCH hoặc virus ái hạch như sự hiện diện đồng thời hoặc gần đây của các virus như Cytomegalovirus (CMV), Rubella, hoặc Epstein-Barr Virus (EBV) có thể gây kích thích hệ miễn dịch tạo ra các kháng thể đa dòng làm nhiễu kết quả xét nghiệm IgM. Do đó, không được chỉ dựa vào một mình IgM dương tính để kết luận là đang nhiễm mới.
Nhà lâm sàng cần chỉ định làm thêm xét nghiệm IgG và độ ái lực IgG để phân biệt:
+ Nếu IgM (+) và IgG (-): Mới nhiễm rất gần đây hoặc IgM dương tính giả, nên cần lặp lại xét nghiệm sau 2 tuần;
+ Nếu IgM (+) và IgG (+) ái lực thấp: Gợi ý nhiễm trùng cấp tính trong vòng vài tháng gần đây;
+ Nếu IgM (+) và IgG (+) ái lực cao: Nhiễm trùng đã xảy ra từ trước khi mang thai (trên 3-5 tháng), nguy cơ truyền sang thai nhi rất thấp.
2. Xử trí ở phụ nữ mang thai
- Nếu tuổi thai dưới 18 tuần và nghi ngờ nhiễm cấp mới: Chỉ định điều trị ngay bằng Spiramycin (liều thường dùng 3 triệu IU/lần, uống 3 lần/ngày) nhằm giảm nguy cơ ký sinh trùng lây truyền qua nhau thai sang thai nhi;
- Khi tuổi thai từ 18 tuần trở lên: Thực hiện thủ thuật chọc ối làm xét nghiệm Real-time PCR để tìm DNA của Toxoplasma gondii trong dịch ối.
- Nếu PCR dịch ối âm tính (không lây sang con): Tiếp tục duy trì dùng Spiramycin cho đến hết thai kỳ;
- Nếu PCR dịch ối dương tính (đã lây sang thai nhi): Chuyển sang phác đồ điều trị mạnh hơn cho thai nhi (phối hợp Pyrimethamine + Sulfadiazine + Acid folinic), đồng thời siêu âm hình thái học chuyên sâu để đánh giá tổn thương.
3. Xử trí ở người bình thường hoặc người suy giảm miễn dịch
- Người có hệ miễn dịch bình thường: Nếu không có triệu chứng lâm sàng, thường không cần điều trị đặc hiệu mà chỉ theo dõi sát;
- Người suy giảm miễn dịch (như HIV/AIDS, lao, suy thận): Cần điều trị tích cực và theo dõi dài hạn do nguy cơ bệnh chuyển nặng hoặc tái hoạt viêm não do Toxoplasma gondii.
Vấn đề 3. Để chẩn đoán chính xác bệnh nhân đang nhiễm ấu trùng Toxocara canis, tại sao người ta không sử dụng kít chẩn đoán IgM anti-Toxocara mà chỉ chỉ dùng phổ biến kit phát hiện kháng thể IgG anti-Toxocara?
Về mặt miễn dịch bệnh lý, kháng thể IgM anti-Toxocara xuất hiện sớm và đạt đỉnh trong 2 tuần đầu sau nhiễm, sau đó giảm dần và mất nhanh do kháng thể IgM nhanh chóng chuyển lớp (class) thành IgE toàn phần (total IgE) trong huyết thanh;
Bên cạnh đó, một số nghiên cứu chỉ ra các kháng thể IgM kháng TES-Ag Toxocara trong huyết thanh của 3 nhóm bệnh nhân nhiễm Toxocara, nhóm nhiễm giun sán khác và nhóm thứ 3 là những người khỏe mạnh bằng xét nghiệm ELISA và Western blot, cho thấy kháng thể IgM được phát hiện trên ELISA và Western blot lần lượt là: 91,4% vs. 94,8% mẫu của người nhiễm Toxocara; 76% vs. 65,3% của người nhiễm giun sán khác; 45,3% vs. 41% của người khỏe mạnh.
Điều này cho thấy chỉ một sự giảm nhẹ khi các kháng nguyên tiết bài tiết (Toxocara Excretory secretory Ag) TES bị glycosyl hóa, không chỉ có glycosidic epitope, mà còn các peptide epitope cũng liên quan đến sự nhận diện & liên kết của các IgM trong đáp ứng miễn dịch chống lại KST, nghĩa là IgM không đặc hiệu để chẩn đoán T. canis.
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn