SGA của trình tự P. vivax
Để kiểm tra mối quan hệ tiến hóa của KST ở vượn và người, họ đã khuếch đại toàn bộ bộ gen ty thể P. vivax thành ba đoạn chồng chéo một phần. Việc này được thực hiện bằng cách sử dụng SGA tiếp theo là giải trình tự khuếch đại trực tiếp, giúp loại bỏ sự tái tổ hợp do trùng hợp Taq gây ra và các lỗi thay thế nucleotide, đồng thời cung cấp sự đại diện tỷ lệ thuận các trình tự KST có mặt trong cơ thể sống. Sự sắp xếp các trình tự này đã tiết lộ hai biến thể nucleotide đơn (SNV) phân biệt tất cả KST ở vượn với tất cả KSTSR ở người. SNV thứ ba được đề xuất trước đócó tính đa hình giữa các mẫu vượn trong tập dữ liệu. Do đó, họ đã thiết kế các mồi PCR để khuếch đại một đoạn (đoạn D) gồm cả hai SNV trên cùng một đoạn khuếch đại SGA. Dù chỉ một phần nhỏ các mẫu phân dương tính với P. vivax tạo ra đoạn mtDNA lớn hơn, họ vẫn có thể tạo ra trình tự đoạn D từ 22 con tinh tinh và 9 con khỉ đột, trong đó 17 con được lấy mẫu trong tự nhiên.
Vì hầu hết các trình tự trong cơ sở dữ liệu được tạo ra bằng PCR thông thường, họ cũng đã sử dụng SGA để khuếch đại trình tự đoạn D từ máu của những người nhiễm P. vivax nhằm tạo ra các trình tự không có lỗi của trùng hợp Taq. Các mẫu này gồm 94 du khách quốc tế, những người đã nhiễm P. vivax khi đến thăm các khu vực SRLH, cũng như 25 cá nhân nhiễm P. vivax từ Trung Quốc, Thái Lan, Myanmar và Ấn Độ và do đó cung cấp một mẫu đại diện toàn cầu về các trường hợp nhiễm P. vivax ở người.Phân tích phát sinh chủng loài của tất cả trình tự mtDNA P. vivax có nguồn gốc từ SGA cho thấy các KSTSR ở vượn tạo thành 2 nhánh riêng biệt. Một nhánh đại diện bởi các trình tự từ chỉ hai mẫu tinh tinh (BQptt392 và DGptt540) gần như khác biệt với các KST còn lại ở vượn và người tương tự như các loài Plasmodium spp. khác, nên có khả năng đại diện cho một loài chưa được xác định trước đây. Tất cả trình tự KSTSR ở vượn khác đều có mối quan hệ gần gũi với nhau và với các trình tự P. vivax ở người, nên dường như đại diện cho một loài duy nhất.P. vivax này, các trình tự có nguồn gốc từ tinh tinh và khỉ đột được phân bố xen kẽ, nhưng tất cả trình tự có nguồn gốc từ người tạo thành một dòng dõi duy nhất được hỗ trợ tốt nằm trong sự phân nhánh của các KST ở vượn. Việc đưa vào các trình tự không phải SGA đã được công bố trước đó đã xác nhận cấu trúc này, mặc dù nhiều trình tự trong cơ sở dữ liệu cho thấy các nhánh dài gợi ý về lỗi PCR. Điều thú vị là, trình tự P. vivax duy nhất được xác định gần đây ở một du khách châu Âu sau khi làm việc trong một khu rừng ở Trung Phi không thuộc dòng P. vivax ở người mà lại nhóm với các KSTSR thu từ tinh tinh và khỉ đột sống hoang dã. Điều này xác nhận nghi ngờ rằng du khách này đã bị nhiễm bệnh do lây truyền chéo loài từ một loài vượn hoang dã.
Vị trí phát sinh chủng loài của trình tự đoạn ty thể D (2.524 bp) từ các chủng P. vivax của vượn và người được thể hiện liên quan đến trình tự tham chiếu KST của người và khỉ Macaque. Tất cả trình tự đều được tạo ra bởi SGA, ngoại trừ các chủng tham chiếu của người (Salvador I, Ấn Độ VII, Mauritania I, Triều Tiên và Brazil I) và linh trưởng từ cơ sở dữ liệu GenBank. Một dòng dõi thứ hai của các trình tự KSTSR liên quan từ các mẫu tinh tinh DGptt540 và BQptt392 có khả năng đại diện cho một loài Plasmodium spp. mới . Cây phả hệ được suy luận bằng phương pháp xác suất tối đa. Các số phía trên và phía dưới các nút biểu thị giá trị bootstrap (≥70%) và xác suất hậu nghiệm Bayes (≥0,95) tương ứng (thanh tỷ lệ biểu thị năm lần thay thế nucleotide).Để kiểm tra tính vững chắc của các mối quan hệ phát sinh chủng loại, họ đã chọn thêm các vùng gen đã được sử dụng trước đây cho các nghiên cứu tiến hóa của P. vivax, chúng gồm các phần của gen protease phân giải casein apicoplast C (clpC) cũng như các gen nhân mã hóa lactate dehydrogenase (ldh), adenylosuccinate lyase (asl), kinase liên quan đến chu kỳ phân chia tế bào 2 (crk2) và β-tubulin (β-tub). Dù số lượng mẫu vượn tạo ra sản phẩm khuếch đại ít hơn, điều này rất có thể là do số lượng bản sao của bộ gen apicoplast và nhân thấp hơn so với mtDNA. Tuy nhiên, nhiều mẫu cho ra nhiều hơn một kiểu gen P. vivax cho thấy sự đồng nhiễm với nhiều biến thể lưu hành địa phương.
Để tăng số lượng trình tự tham chiếu phù hợp, họ cũng đã khuếch đại các đoạn tương tự này từ các mẫu người dương tính với P. vivax và đối với một số vùng gen từ KSTSR khỉ Macaque có liên quan. Các cây phát sinh chủng loại thu được có cấu trúc rất giống nhau, với KSTSR ở người luôn tạo thành một dòng dõi đơn ngành. Hơn nữa, dòng dõi này nằm trong phạm vi phân bố của các trình tự vượn giống P. vivax đối với 5/6 vị trí được thử nghiệm. Ngược lại, các trình tự của tinh tinh và khỉ đột lại xen kẽ nhau, cho thấy P. vivax thường được truyền giữa hai vật chủ vượn này.
Hình 4. Quan hệ tiến hóa Plasmodium spp. Các chữ màu Plasmodium spp. nhiễm tren người (màu đỏ), tinh tinh (xanh da trời) và khỉ đột (xanh lá cây). Bốn nhóm Plasmodium spp. chỉ ra thiết kế các giống phụ của các KSTSR ở linh trưởng.
Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0020751916301229
Trình tự gen apicoplast và gen nhân cũng xác nhận sự tồn tại của loài Plasmodium thứ hai, có quan hệ gần gũi ở loài vượn. Trình tự thu được cho các gen clpC, ldh và crk2 từ một trong hai mẫu tinh tinh cho ra trình tự mtDNA khác biệt (DGptt540 và BQptt392) lại một lần nữa rõ ràng khác biệt với P. vivax. Trong cây phát sinh loài mtDNA, ldh và 5′ crk2, loài mới này là họ hàng gần nhất của P. vivax dù chỉ tìm thấy bằng chứng mạnh cho điều này ở hai cây phả hệ sau, trong khi ở các cây khác, mối quan hệ không được xác định rõ ràng. Mặc dù loài mới này có vẻ hiếm, nhưng nó đã được tìm thấy trong các mẫu từ hai địa điểm cách nhau khoảng 110 km. Hơn nữa, việc phát hiện ra nó phụ thuộc vào phản ứng chéo của các mồi PCR đặc hiệu cho P. vivax cho thấy tỷ lệ phổ biến và mối liên hệ với vật chủ của nó vẫn cần được xác định. Tuy nhiên, trình tự KSTSR hiện có cho thấy vượn châu Phi không chỉ mang KSTSR P. vivax mà còn cả họ hàng gần nhất của nó.
Sự đa dạng tương đối của P. vivax ở vượn và người
Phân tích phát sinh chủng loài cho thấy các chủng P. vivax ở người có nguồn gốc từ sự phân hóa của KST ở vượn, dự đoán các chủng ở người sẽ thể hiện sự đa dạng di truyền thấp hơn. Để kiểm tra điều này, họ đã tính toán sự đa dạng nucleotide tương đối của trình tự P. vivax ở vượn và người được tạo ra từ SGA. Thật vậy, số lượng khác biệt nucleotide trung bình trên mỗi vị trí (π) cao hơn ở KST vượn so với KST ở người tại tất cả locus được thử nghiệm. Tuy nhiên, mức độ đa dạng tăng lên khác nhau giữa các gen. Sự đa dạng của trình tự mtDNA chỉ cao hơn 1,4 lần ở KSTSR vượn so với ở người, trong khi đối với trình tự apicoplast, giá trị này cao hơn 6 lần. Đối với các gen nhân, trình tự ở vượn đa dạng hơn từ 9 (asl, ldh) đến 50 (crk2) lần. Nếu mức độ đa dạng thực sự tương tự nhau ở KST của vượn và người, thì rất khó có thể quan sát thấy sự khác biệt này một cách nhất quán.
Sự đa dạng tương đối của các gen khác nhau cũng khác nhau giữa KSTSR ở vượn và người. Ví dụ, đối với KSTSR ở vượn, trình tự gen nhân đa dạng hơn mtDNA từ 12 đến 25 lần, trong khi tỷ lệ này chỉ là 1-2 đối với KST ở người. Trong trường hợp không có chọn lọc tích cực hoặc thay đổi nhân khẩu học, sự đa dạng tương đối trong cùng một loài sẽ tương tự như sự đa dạng giữa các loài. Do đó, để so sánh họ đã tính toán khoảng cách giữa các trình tự tương đồng từ P. vivax và P. cynomolgi có quan hệ gần.
Hình 5. Đặc điểm di truyền một số loài KSTSR trên quần thể linh trưởng
|Nguồn: https://www.nature.com/articles/nature07327
Đối với 4/5 locus, sự đa dạng tương đối theo giá trị mtDNA giữa các chủng P. vivax ở vượn rất giống với sự phân kỳ tương đối giữa các loài; ngoại lệ duy nhất là crk2, có sự đa dạng bất thường giữa các KST ở vượn (so với các locus nhân khác), nhưng cũng là gen nhân được bảo tồn nhiều nhất giữa các loài. Ngược lại, giá trị đa dạng gen nhân và gen apicoplast (so với mtDNA) giữa các chủng P. vivax ở người lại thấp một cách đáng kể. Sự đa dạng giảm sút này giữa các chủng P. vivax ở người rất có thể phản ánh một sự suy giảm đa dạng, tùy thuộc vào thành phần quần thể ban đầu, có thể đã ảnh hưởng đến sự đa dạng tương đối của bộ gen bào quan và bộ gen nhân khác nhau.
Một số giải thích cho sự khác biệt
Phát hiện cho thấy các loài vượn hoang dã ở trung tâm Châu Phi bị nhiễm trùng lan rộng với nhiều chủng P. vivax khác nhau và mang một loài Plasmodium spp. riêng biệt nhưng có liên quan, điều này cung cấp cái nhìn sâu sắc mới về lịch sử tiến hóa của P. vivax ở người và có khả năng giải quyết nghịch lý rằng một đột biến mang lại khả năng kháng P. vivax xảy ra với tần suất cao ở chính khu vực mà ký sinh trùng này không hiện diện. Những kết quả này cho thấy P. vivax ở người bắt nguồn từ một loài Plasmodium spp. lây nhiễm cho tinh tinh và khỉ đột và cho thấy nguồn gốc ở châu Phi chứ không phải ở châu Á như giả định trước đây. Một cách giải thích về cây phát sinh chủng loài là một sự chuyển đổi vật chủ duy nhất từ vượn đã tạo ra P. vivax ở người, tương tự nguồn gốc của P. falciparum ở người. Tuy nhiên, điều này dường như không khả thi trong trường hợp này vì P. vivax ở vượn không phân chia thành các dòng dõi đặc trưng của khỉ đột và tinh tinh và vì con người dễ bị nhiễm cả P. vivax tự nhiên và nhiễm P. vivax thực nghiệm 27 ở vượn.
Hình 5. Các thách thức liên quan đến sự hiểu biết P. vivax và tiệt trừ bao gồm: (a) Một sự thiếu đi công cụ chẩn đoán thể ngủ, phân biệt P. vivax với các loài Plasmodium spp. khác, thiếu đi phương pháp và kỹ thuật làm sao nuôi cấy liên tục in vitrovà thiếu sự hình thành tiêu chuẩn đánh giá mức độ nghiêm trọng của P. vivax; (b) P. falciparum bao gồm tính đa hình trong các gen đặc biệt dẫn đến kháng thuốc, Đột biến mất đoạn HRP2/3 trên quần thể ở khắp nới trên toàn cầu
|Nguồn: https://smart.servier.com (accessed on 20 March 2021).
Do đó, một cách giải thích hợp lý hơn là một dòng P. vivax tổ tiên đã có khả năng lây nhiễm cho con người, khỉ đột và tinh tinh ở Châu Phi cho đến khi đột biến Duffy âm tính bắt đầu lan rộng (có lẽ khoảng 30.000 năm trước) và loại bỏ P. vivax khỏi con người ở đó. Theo kịch bản này, P. vivax lây nhiễm cho người hiện nay đại diện cho một dòng dõi bị thắt cổ chai đã sống sót sau khi lan rộng ra khỏi Châu Phi. Gần đây hơn nhiều, cùng với sự di cư của vật chủ, P. vivax ở người đã được tái du nhập vào Châu Phi. Gần đây, một số kịch bản thay thế về nguồn gốc P. vivax ở vượn và người đã được thảo luận, nhưng không kịch bản nào trong số này có vẻ hợp lý dựa trên dữ liệu hiện tại.
Tất cả các mô hình trước đây đều cho rằng P. vivax có nguồn gốc từ người ở châu Á, sau sự lây truyền chéo loài của một loại ký sinh trùng ở khỉ, và sau đó con người đã mang ký sinh trùng này đến các loài vượn ở Châu Phi. Giả định này dựa trên thực tế là tất cả các họ hàng gần nhất được biết đến của P. vivax dường như đều lây nhiễm cho các loài linh trưởng châu Á.
Tuy nhiên, giờ đây chúng tôi chứng minh rằng tinh tinh mang một loài Plasmodium có quan hệ gần gũi hơn với P. vivax so với bất kỳ loại ký sinh trùng nào ở các loài linh trưởng châu Á. Do đó, giả định rằng tổ tiên chung của hai loài này tồn tại ở châu Phi là hợp lý hơn. Làm thế nào dòng dõi này được đưa vào các loài vượn ở châu Phi vẫn chưa được biết; tuy nhiên, điều này dường như đã xảy ra từ rất lâu trước khi P. vivax xuất hiện .
Để giải thích mức độ đa dạng di truyền hiện tại ở các chủng P. vivax ở vượn và người, các mô hình trước đây viện dẫn nguồn gốc Châu Á hoặc yêu cầu P. vivax ở người tại Châu Á phải tuyệt chủng trước khi tái sinh từ Châu Phi, hoặc cần P. vivax Châu Á phải trải qua một giai đoạn “thắt cổ chai” (nguyên nhân chưa rõ. Ngược lại, mô hình nguồn gốc Châu Phi không yêu cầu quần thể P. vivax tổ tiên (nay đã tuyệt chủng) ở người tại Châu Á mà chúng ta cần giải thích theo hướng đa dạng giảm của KSTSR ở người là kết quả của giai đoạn “thắt cổ chai” từ Châu Phi như đã từng thấy ở loài P. falciparum và ở chính con người. Người ta cũng cho rằng P. vivax có nhiều khả năng đã lan từ Châu Á sang Châu Phi hơn vì các chủng P. vivax ở người tại Châu Á dường như đa dạng nhất và vì các phân tích phát sinh địa lý cho thấy tỷ lệ di cư cao từ Châu Á, đặc biệt là Ấn Độ- sang châu Phi.
Tuy nhiên, điều này hiện được giải thích đơn giản hơn bởi sự tuyệt chủng của P. vivax ở người tại Châu Phi, nơi có tính đa dạng cao và do có sự lan rộng của đột biến Duffy âm tính trên quần thể. Các chủng P. vivax hiện đang lây nhiễm cho người ở Châu Phi thực sự có nguồn gốc từ Châu Á, nhưng điều này phản ánh sự tái du nhập và chỉ xảy ra gần đây, có lẽ cùng với sự di cư của người Châu Á đến Madagascar trong vòng vài nghìn năm qua.
Nếu nguồn gốc của P. vivax là do lây truyền từ khỉ đuôi dài ở Đông Nam Á, điều này sẽ ngụ ý một lịch sử tiến hóa phức tạp, xét đến các mốc thời gian đã được viện dẫn. Ước tính về thời điểm tổ tiên chung cuối cùng của P. vivax ở người thường vào khoảng hàng trăm nghìn năm trước. Sử dụng trình tự mtDNA, tổ tiên này được ước tính đã tồn tại khoảng 400.000 năm trước và một so sánh gần đây hơn về trình tự bộ gen nhân cho thấy một ngày tương tự. Người hiện đại được cho là đã tiến hóa ở Châu Phi và lần đầu tiên đến châu Á không quá 60.000 năm trước.
Do đó, nếu ước tính về mốc thời gian hợp nhất các dòng P. vivax ở người là chính xác, thì vật chủ nhận sự lây truyền từ khỉ đuôi dài phải là một loài hominin nào đó trước đó, và P. vivax phải đa dạng hóa trong một thời gian dài ở vật chủ đó trước khi nhiều dòng được truyền sang người hiện đại sau khi họ xuất hiện từ Châu Phi.
Sự tồn tại của ổ chứa P. vivax trong tự nhiên có ý nghĩa quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng. Thứ nhất, nó giải đáp bí ẩn về các ca nhiễm P. vivax ở những du khách trở về từ vùng mà 99% dân số có Duffy âm tính. Thứ hai, nó làm dấy lên khả năng con người sống gần tinh tinh và khỉ đột có thể bị nhiễm P. vivax từ vượn.
Hình 6. Phân tích phả hệ di truyền các chủngPlasmodium vivaxtừ mẫu máu của các bệnh nhân sốt rét tại Florida, Mỹ 2023 chỉ ra có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ. A) Phân bố địa lý 53 chủng chất lượng cao toàn cầu thu thập từ >1,000 mẫu P. vivax. B) Chủng P. vivaxở Florida đang kết cụm theo cụm tại Trung/ Nam Mỹ. Cây phả hệ di truyền được cấu trúc thông qua sử dụng phương pháp tối đa hóa và 1000 bootstrap sao chép thẻ hiện trong nhánh. Mã hóa màu sắc theo nguồn gốc địa lý của các phân lập trong bảng A. Chùm của Mỹ và Trung/ Nam Mỹ màu xám có bóng. Các chủng Florida P. vivax được ký hiệu 1AS1, 2AS2, SAS3, 4AS4.
Nguồn: https://www.researchgate.net/Autochthonous_Plasmodium_vivax_Infections_Florida_USA2023
Một nghiên cứu gần đây về những cá nhân đến khám tại một phòng khám sức khỏe ở Congo thấy 10% mang kháng thể đặc hiệu với giai đoạn tiền hồng cầu P. vivax cho thấy sự phơi nhiễm liên tục với P. vivax từ một nguồn không xác định. Vì P. vivax từ vượn rất phổ biến, đặc biệt là ở Tây Trung Phi, tinh tinh và khỉ đột sống hoang dã có thể đóng vai trò là ổ chứa mầm bệnh, đặc biệt là ở những vùng có sự đổ bộ của người có kết quả xét nghiệm Duffy dương tính thông qua thương mại và du lịch trùng hợp với sự gia tăng xâm lấn rừng và phá hủy môi trường sống của vượn. Mặc dù những cá nhân âm tính với thụ thể Duffy thường được bảo vệ khỏi nhiễm trùng P. vivaxgiai đoạn trong máu, các nghiên cứu gần đây ở Madagascar và Ethiopia đã chỉ ra P. vivax không hoàn toàn phụ thuộc vào thụ thể Duffy.
Do đó, việc đánh giá khả năng KSTSR ở vượn có được kiểu hình này là rất quan trọng, một khi các yếu tố di truyền cơ bản đã được xác định trong các chủng ở người. Khả năng P. vivax ở vượn có thể lây lan qua du lịch quốc tế đến các quốc gia nơi P. vivax ở người đang lây truyền mạnh cũng cần được xem xét. Vì P. vivax ở vượn đa dạng hơn nhiều so với P. vivax ở người, nên nó có khả năng thích nghi cao hơn để né tránh các biện pháp điều trị và phòng ngừa, đặc biệt nếu KST ở người và vượn có thể tái tổ hợp.
Với khuynh hướng chuyển đổi vật chủ đã được ghi nhận của P. vivax, việc sàng lọc những người dương tính và âm tính với thụ thể Duffy ở Tây Trung Phi, cũng như các vectơ muỗi truyền bệnh, để tìm sự hiện diện của P. vivax ở vượn dường như quan trọng.
Các nghiên cứu như vậy đã trở nên khả thi nhờ sự phát triển của các công cụ phân tử giúp phân biệt P. vivax ở vượn với ở người, đồng thời cho phép sàng lọc mẫu phân để tìm DNA của KST có nguồn gốc từ gan ngay cả khi không có dấu hiệu nhiễm trùng máu rõ ràng. Những kết quả này cần thiết để hỗ trợ các nỗ lực kiểm soát và xóa bỏ sốt rét, cũng như để đánh giá nguy cơ lây truyền từ động vật sang người.
Tổng cộng 5.469 mẫu phân mới hoặc đã được thu thập trước đó từ tinh tinh sống hoang dã P. troglodytes, khỉ đột phương Tây G. gorilla, khỉ đột phương Đông G. beringei và tinh tinh lùn P. paniscus để nghiên cứu dịch tễ học phân tử về retrovirus ở khỉ và KST Laverania đã được chọn để sàng lọc P. vivax .
Tất cả mẫu vật đều có nguồn gốc từ các loài vượn chưa quen với con người, ngoại trừ 170 mẫu từ tinh tinh ở Vườn Quốc gia Gombe, Tanzania và 26 mẫu từ khỉ đột ở Khu bảo tồn Dzanga-Sangha, Trung Phi, những con vật này đã quen với sự hiện diện của người quan sát. Các mẫu được thu thập (tỷ lệ 1:1) trong dung dịch RNA later, vận chuyển ở nhiệt độ môi trường và bảo quản ở -80°C. DNA phân được chiết xuất bằng bộ QIAamp Stool DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) và được sử dụng để khuếch đại các phần của bộ gen ty thể vật chủ nhằm xác nhận nguồn gốc loài và phân loài.
Một tập hợp con cũng được phân tích vi vệ tinh tại 4-8 vị trí đa hình để ước tính số lượng cá thể được lấy mẫu. Ngoài các mẫu phân từ quần thể hoang dã, họ cũng thu thập mẫu phân và máu từ tinh tinh và khỉ đột được nuôi nhốt trong các chuồng ngoài trời ngay sát môi trường sống của các loài linh trưởng hoang dã, các mẫu này gồm 113 mẫu phân và 66 mẫu máu từ tinh tinh được nuôi tại Trung tâm Cứu hộ Sanaga Yong, 2 mẫu phân từ khỉ đột và 14 mẫu máu từ tinh tinh được nuôi tại Trung tâm Động vật hoang dã Limbe và 8 mẫu máu từ 6 con tinh tinh và 2 con khỉ đột được nuôi tại Trung tâm Cứu hộ Động vật hoang dã Vườn quốc gia Mfou. Tất cả đều nằm ở Cameroon.
Các mẫu phân được thu thập từ những cá thể đã biết dưới sự quan sát trực tiếp. Các mẫu máu được lấy bằng phương pháp chọc tĩnh mạch (mẫu máu khô, máu toàn phần, lớp tế bào bạch cầu, hồng cầu) và là vật liệu còn lại từ các cuộc kiểm tra sức khỏe định kỳ hoặc được thu thập cho các mục đích thú y (chẩn đoán) cụ thể. Việc thu thập máu và phân đã được Bộ Lâm nghiệp và Động vật hoang dã Cameroon phê duyệt. Hai con tinh tinh tại khu bảo tồn SY bị nghi ngờ mắc bệnh sốt rét và được lấy mẫu trong thời gian bị sốt cao. Một con có kết quả xét nghiệm máu dương tính tại chỗ và sau đó được xác định là dương tính với P. reichenowi bằng phương pháp PCR , trong khi con kia dương tính P. vivax ở vượn bằng phương pháp PCR, cả hai đều đáp ứng tốt với điều trị thuốc sốt rét. Một vài con tinh tinh khác dương tính với Laverania hoặc P. vivax ở vượn bằng PCR đều có các triệu chứng nhẹ hơn tại hoặc gần thời điểm lấy mẫu, nhưng phần lớn các con vượn nuôi nhốt, bao gồm cả một số con dương tính với Laverania và/hoặc trình tự không phải Laverania qua phân tích máu, đều không có triệu chứng tại thời điểm lấy máu.
Hình 7. Các mốc lịch sử nghiên cứu về KSTSR Plasmodium vivaxtrên thế giới
https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2023.1144453/full
Những cá thể này cũng có kết quả xét nghiệm máu âm tính. Các mẫu được vận chuyển tuân thủ các quy định của Công ước về Thương mại Quốc tế các Loài Động thực vật hoang dã nguy cấp và giấy phép nhập khẩu và xuất khẩu cụ thể của từng Quốc gia. DNA được chiết xuất từ máu toàn phần và các vết máu khô bằng bộ QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA).
Mẫu bệnh phẩm khỉ
Để điều tra phạm vi vật chủ đầy đủ của P. vivax, họ đã sàng lọc mẫu máu từ 998 loài linh trưởng không phải người ở Cameroon và Congo. Việc thu thập và đặc điểm phân tử các mẫu đã được mô tả, ngoại trừ mẫu từ các địa điểm thực địa. Các mẫu được thu thập từ thịt thú rừng linh trưởng dưới dạng các đốm máu khô hoặc máu toàn phần bằng các chiến lược được thiết kế đặc biệt để không làm tăng nhu cầu. DNA được chiết xuất bằng kit máu QIAamp (Qiagen, Courtaboeuf, Pháp) và nguồn gốc loài được xác định bằng cách khuếch đại một đoạn mtDNA 386 bp gồm gen 12S rRNA bằng PCR một vòng. Các mẫu linh trưởng không phải người được thu thập với sự chấp thuận của Bộ Y tế và Môi trường và Ủy ban Đạo đức Quốc gia của Cameroon và Congo.
Mẫu bệnh phẩm người
Để tăng số lượng trình tự tham chiếu P. vivax ở người và tạo ra các trình tự không có lỗi PCR, đã thu thập mẫu toàn cầu về các ca nhiễm P. vivax ở người. Các mẫu này gồm mẫu máu khô hoặc mẫu DNA từ (i) 61 du khách Quốc tế được chẩn đoán tại Phòng thí nghiệm tham chiếu sốt rét của Trường Y học Nhiệt đới và Vệ sinh London, Anh (được ký hiệu là MRL), (ii) 35 du khách Quốc tế được chẩn đoán tại Khoa Bệnh truyền nhiễm, Bệnh viện Đại học Karolinska, Stockholm, Thụy Điển (được ký hiệu là SW) và (iii) 32 cư dân của các khu vực lưu hành sốt rét ở Trung Quốc (được ký hiệu là GX; n=10), Myanmar (V0; n=10), Thái Lan (PVAR; n=2) và Ấn Độ (IN; n=10), những người đã tìm kiếm điều trị tại các phòng khám địa phương. Trong tất cả trường hợp, nhiễm P. vivax ban đầu được xác định bằng kính hiển vi và được xác nhận bằng PCR chẩn đoán tiếp theo là giải trình tự khuếch đại trực tiếp.
DNA được chiết xuất từ máu toàn phần hoặc mẫu máu khô bằng Bộ dụng cụ QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Các mẫu ADN ẩn danh được MRL thu thập trước đây được cung cấp theo nhiệm vụ của trung tâm để thực hiện giám sát dịch tễ học liên quan đến bệnh sốt rét nhập khẩu vào Vương quốc Anh. Tất cả các đối tượng khác đã cung cấp sự đồng ý bằng văn bản cho việc thu thập và phân tích mẫu, các mẫu được gửi đi mà không có thông tin nhận dạng bệnh nhân và các thông tin khác của bệnh nhân, ngoại trừ quốc gia (đã biết hoặc được cho là) nơi nhiễm P. vivax . Nghiên cứu đã được Hội đồng Đánh giá Đạo đức của Đại học Pennsylvania, Viện Karolinska và Đại học Tiểu bang Pennsylvania phê duyệt.
Loài Plasmodium khác
DNA bộ gen từ mẫu máu khô chứa P. inui (mã số MRA-486F), P. simiovale (MRA-488F), P. cynomolgi (MRA-350G) và P. fragile (MRA-352G) được lấy từ Trung tâm Tài nguyên Thuốc thử Tham chiếu và Nghiên cứu Sốt rét (MR4) để tạo ra các trình tự tham chiếu có nguồn gốc từ bộ gen đơn lẻ phục vụ cho các phân tích phát sinh chủng loài. Các mẫu phân của vượn được phân tích bằng phương pháp microsatellite đã được báo cáo, ngoại trừ các mẫu tinh tinh lùn thu được tại điểm thực địa TL. DNA trong phân được chiết xuất và sử dụng để khuếch đại 08 vị trí microsatellite đa hình. Các sản phẩm khuếch đại được phân tích trên máy giải trình tự tự động và được xác định kích thước bằng GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems).
Để nhận dạng cá thể, các mẫu phải được nhóm theo kiểu gen mtDNA. Trong mỗi kiểu gen, các mẫu sau đó được nhóm theo kiểu gen microsatellite. Vì các mẫu bị phân hủy một phần do bảo quản lâu ở nhiệt độ môi trường, cho phép sai lệch alen ở tối đa 6 vị trí để phòng ngừa mất alen, nhưng chỉ khi chúng đại diện cho một alen bị thiếu. Phương pháp xác định kiểu gen thận trọng này có thể đánh giá thấp số lượng cá thể được sàng lọc, nên phản ánh ước tính tối thiểu. Mẫu có bằng chứng về sự pha trộn DNA (nhiều đỉnh cho cùng một vị trí) đã bị loại bỏ.
(còn nữa) --> Tiếp theo Phần 3
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn