Việc hình thành và từng bước nâng cao điểm kính hiển vi tại các tuyến là một điểm rất quan trọng trong thực hành cận lâm sàng để phục vụ cho công tác phát hiện, chẩn đoán và điều trị sốt rét tại các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. Trong quá trình giám sát công tác chẩn đoán và điều trị sốt rét tại hầu hết các tuyến bệnh viện trong khu vực miền Trung - Tây Nguyên (2007-2010), kết quả cho thấy tỷ lệ xét nghiệm chỉ đạt dao động quanh 90% về các mặt của một hệ thống xét nghiệm ký sinh trùng sốt rét (KSTSR), hiếm khi có nơi đạt 100% toàn diện. Tỷ lệ soi sai, sót trung bình chiếm 16.23%, trong đó lỗi sai quan trọng nhất là trả lời kết quả âm tính giả (từ (+) trả lời thành (-) qua khảo sát và đánh giá kết quả soi tại 122 điểm kính hiển vi trong gần 4 năm (gồm cả tuyến bệnh viện Trung ương, tỉnh, huyện và xã).
Về phần trả lời kết quả xét nghiệm cũng nên được đề cập ở đây, bởi lẽ từ lâu các cơ sở điều trị chỉ dừng lại trả lời kết quả xét nghiệm dưới dạng dấu cộng (+) như Ft++, Ftg++, hoặc Vtg++, điều này dù có định loại và thể, song xét về khâu định lượng chỉ mang tính ước đoán mà thôi, chứ không thể dựa vào nó để tiên lượng hay theo dõi diễn tiến bệnh như thế nào? chỉ có một vài bệnh viện huyện hoặc tỉnh, gần đây có chuyển sang kết quả có đếm mật độ KSTSR/mL máu, song cũng không phải lúc nàocũng cho kết quả là đếm số lượng, chỉ chú ý đến khi ca bệnh là sốt rét ác tính (!). Việc soi, đếm và trả lời kết quả xét nghiệm KSTSR cả định loại, thể KSTSR gây bệnh và mật độ KSTSR là khâu cần thiết vừa giúp chẩn đoán vừa theo dõi diễn tiến và tiên lượng bệnh nhân một cách thấu đáo nhất. Song công việc ấy, hiện các xét nghiệm viên dường như không mấy quan tâm, hoặc họ chỉ học soi cách phát hiện KSTSR chỉ 2-3 tuần,…nên còn nhiều hạn chế trong khâu này. Để đáp ứng nhu cầu và khuyến cáo các đơn vị điều trị, ít nhất là từ tuyến bệnh viện huyện trở lên nên áp dụng việc đếm KSTSR như một công việc thường quy khi trả lời kết quả xét nghiệm KSTSR, chúng tôi đưa ra các phương pháp đếm MĐKSTSR để đồng nghiệp tham khảo và vận dụng, thông tin và tài liệu, chúng ta có thể tham khảo thêm “Bench Aids For The Diagnosis Of Malaria”.
I. Xác định mật độ ký sinh trùng sốt rét – phương pháp đếm (trong 1 microlite).
Sau đây là 1 phương pháp thực hành đủ độ chính xác. Nó dựa trên số lượng ký sinh trùng sốt rét /µl máu trong 1 lam giọt dày. Số lượng ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) đếm được này tính theo 1 số lượng bạch cầu (BC) đã được xác định trước, trung bình 8000 bạch cầu/µl, được coi là chuẩn. Mặc dù có sự không chính xác do thay đổi số lượng BC giữa những người khỏe mạnh và sự thay đổi đó càng lớn hơn ở người ốm, độ chuẩn này cho phép so sánh 1 cách hợp lý.
Trước khi đếm, cần xét nghiệm khoảng 0,25µl máu (khoảng 100 vi trường, sử dụng thị kính số 7 và vật kính dầu 100) trên lam giọt dày để xác định loài ký KSTSR và các giai đoạn phát triển của KSTSR. Khi đã làm xong, các bước trên, tiến hành đếm KSTSR trên lam giọt dày như sau:
1. Cần có 2 máy đếm để đếm KSTSR và BC riêng rẽ.
(a) Nếu sau khi đếm được 200 BC, đếm được 10 KSTSR hoặc nhiều hơn nữa, thì ghi kết qủa vào mẫu báo cáo cho biết số KSTSR trên 200 BC.
(b) Nếu sau khi đếm được 200 BC, chỉ đếm được 9 KSTSR hay ít hơn, thì tiếp tục đếm cho đủ 500 BC, và ghi số lượng KSTSR trên 500 BC.
2. Trong mỗi trường hợp trên, đếm KSTSR tương ứng với số lượng BC có thể đổi ra thành số KSTSR/ µl bằng công thức toán đơn giản sau đây:
Điều này có nghĩa là nếu đếm 200 BC, số KSTSR nhân với 40 và nếu đếm 500 BC, số KSTSR nhân với 16.
3. Trên thực tế thông thường người ta đếm tất cả các loài KSTSR có mặt, bao gồm cả hai thể vô tính và thể hữu tính. Cá biệt đếm riêng số giao bào P.falciparum, nhưng khi đã đếm xong còn phải đếm KSTSR chung.
II. Xác định ước lượng mật độ KSTSR theo hệ thống dấu cộng (+):
Một phương pháp đơn giản hơn, ước lượng KSTSR trên lam giọt dày là sử dụng hệ thống dấu cộng. Phương pháp này ít thỏa đáng. Hệ thống cộng (+) sử dụng 1 mã từ 1 đến 4 ký hiệu cộng (+) như sau:
Phương pháp này sử dụng khi không thể thực hiện được phương pháp đếm KSTSR/1µl máu là phương pháp được chấp nhận hơn.
Phần chú giải:
Các bước đếm KSTSR:
-Xác định sự hiện diện KSTSR trên lam máu giọt dày.
-Xác định loài, thể KSTSR.
-Đếm KSTSR : đi từng vi trường, đếm BC trước (hoặc ngược lại), tiếp theo là KSTSR và chuyển sang vi trường khác (tương tự như đếm HC hay BC, theo hình chữ chi hoặc hình luống cày, tránh lập lại. Đếm BC và KSTSR hết vi trường, mặc dù đã đủ 200 BC, 500 BC hoặc 500 KSTSR).
Để tăng độ chính xác và bớt tốn thời gian khi đếm, yêu cầu lam máu giọt dày phải đủ lượng máu, đạt 15 – 20 BC/ vi trường (nếu thưa BC khi đếm mất nhiều thời gian).
Mục 2 (a,b):
a. KSTSR và bạch cầu đếm được: 10 KSTSR/200 BC, áp dụng công thức trên:
Hay đơn giản công thức, thì nhân 40: 10 KSTSR x 40 = 400 KSTSR/µl
b. KSTSR và bạch cầu đếm được: 9 KSTSR/500 BC, áp dụng công thức trên:
Hay đơn giản công thức,thì nhân 16: 09 KSTSR x 16 = 144 KSTSR/ µl
c. Ví dụ khác:
Trường hợp KSTSR mật độ cao, đếm KSTSR đến 500 thì dừng lại, áp dụng công thức (*), ví dụ: đếm được 512 KSTSR và BC là 52 ( 512/52)
Với trường hợp (c) mà đếm BC đến 200, thì đếm KSTSR chắc “ đuối mất”, lần sau không ai dám đếm nữa!
Cách trả lời kết quả xét nghiệm với các kết quả đếm trên:
a, KSTSR: P.FT+ = 400 / µl
b, KSTSR: P.FT+ = 144 / µl.
c,KSTSR: P.FT++++= 78.769/ µl
Để phục vụ cho công tác điều trị, người ta chỉ quan tâm đếm các thể vô tính ( thể tư dưỡng -Trophozoite (T) và thể hoa thị - Schizonte (S)) gây nguy hại cho chính bệnh nhân.
Trường hợp bệnh nhân bị nhiễm vừa thể vô tính ,vừa thể hữu tính (giao bào- Gametocyte), lấy trường hợp thứ 3 (c) làm ví dụ, nếu có thêm giao bào thì ghi kết quả như sau:
KSTSR: P.FT ++++ = 78.769/ µl
P.FT ++++G+
Người ta sẽ hiểu: Bệnh nhân có nhiễm thể giao bào (gametocyte (G)) nhưng không đếm, mà chỉ đánh giá mật độ G theo hệ thống cộng (+), có nghĩa là78.769 KSTSR chỉ có thể tư dưỡng (Trophozoite).
Chắc ban đầu, các bác sĩ lâm sàng có thể thấy khó chụi, nhưng sau đó sẽ thấy lợi ích của phương pháp định lượng KSTSR này. Ví dụ: trường hợp 3, có thể suy luận:
| KSTSR: | P.FT ++++= 78.769/ µl
P.FT ++++G+
Số lượng hông cầu: 2.500.000/ µl |
Một vấn đề nữa, không thể bỏ qua,khi đếm KSTSR, khi mật độ 1+, 2++ thì đếm dễ dàng, nhưng từ 3+ trở lên hoặc KSTSR dày đặc vi trường (như bánh tráng rắc mè) thì đếm làm sao đây? Kinh nghiệm của chúng tôi, cải tiến buồng đếm như sau: lấy lam kính mới mỏng tốt, cắt vừa vặn, dài bằng đường kính vòng cao su có sẵn trên đầu thị kính (hình như vòng cao su này để giảm va chạm kiếng của người soi kính hiển vi – nhà SX), kẻ ca-rô bằng bút viết kính, thưa dày tùy theo mình thích như buồng đếm HC – BC, sau đó nhẹ nhàng luồn vào trong vòng cao su để đếm. Khi không cần thiết, lấy ra cất. Hiện tại, trên thương trường các hãng SX kính hiển vi, có thể bán buồng đếm này, nhưng khó mua, do mua số lượng ít!
Tài liệu hướng dẫn cách đếm KSTSR trên, có thể tiếp cận bằng cách vào Google: Basis malaria microscopy (Part I and II) Preface, chọn bài học số 10 (Learing unit 10: routine examination of blood films for malaria parasite và đến mục Method 1, tương tự trang tư liệu trên. Quyển sách này, đọc, in cop thỏa mái, có lẽ vì đến giai đoạn miễn phí!
Năm ngoái, khi nghiên cứu thực nghiệm, WHO đề nghị chúng tôi áp dụng công thức:
Khi yêu cầu độ chính xác, giá trị thật của bạch cầu nên được tính toán chính xác để tính ra mật độ KSTSR, không dùng 8000 BC. Về hình ảnh các loại KSTSR, xin vui lòng vào trang vào trang
website: www.dpd.cdc.gov/dpdx/htm/imagelibrary/malaria.htm hoặc vào thẳng Google à CDC image library à DPDx-parasite image library à chọn M-R và chọn malaria sẽ ra hình ảnh điển hình của 5 loài KSTSR: P. f, P.v, P.m, P.o và P. k (P. knowlesi).