|
Kỹ thuật xét nghiệm ELISA tìm kháng thể sán lá gan lớn
Bạn Nguyễn Thị Hoa có địa chỉ nguyenthi…@gmail.com-Hoàng Diệu, TP. Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế là sinh viên chuyên nghành thú y đang thực hiện đề tài về chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn cần hiểu rõ hơn về phương pháp và cách đọc kết quả xét nghiệm ELISA. Đây là câu hổi của bạn Hoa cũng như của nhiều bạn đọc quan tâm khác, Ban Biên tập xin chia sẻ đến các bạn quy trình xét nghiệm ELISA chẩn đoán sán lá gan lớn và theo cách tính kết quả dựa trên mật độ quang và cách tính dựa trên hiệu giá kháng thể tính mắt thường. Kỹ thuật xét nghiệm ELISA tìm kháng thể SLGL Dùng bộ thử ELISA phát hiện kháng thể IgG đặc hiệu Fasciola spp trong huyết thanh người bị nhiễm SLGL. Bộ thử ELISA sán lá gan lớn hoạt động theo nguyên tắc phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể. Kháng nguyên Fasciola spp. đã gắn trong các giếng nhựa polystyrene tóm bắt kháng thể bám trên giếng nhựa bằng cộng hợp kháng IgG người đánh dấu men peroxidase. Kỹ thuật này gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: Kháng nguyên được gắn vào giá nhựa polystyrene (đã gắn sẵn) - Giai đoạn 2: Phủ huyết thanh bệnh nhân cần phát hiện kháng thể. - Giai đoạn 3: Phủ cộng hợp là IgG thỏ kháng IgG người gắn men peroxydase lên phức hợp kháng nguyên - kháng thể vừa hình thành. Cuối cùng, phủ cơ chất có bản chất là một chất hóa học để hiện màu phản ứng nếu kết quả dương tính: có màu, hoặc âm tính: không có màu hay màu rất nhạt. Trong nghiên cứu này, sử dụng kit chẩn đoán ELISA của trường Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh sản xuất hướng dẫn với hiệu giá kháng thể OD ≥ 1.0 được xem là dương tính. Kết quả nghiên cứu của kít có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 95,23% đã được Bộ Y tế nghiệm thu.  | Hình 2 |
Nguyên tắc hoạt động của bộ thuốc thử Bộ thử ELISA hoạt động bằng nguyên tắc phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể. Kháng nguyên Fasciola spp đã gắn trong các giếng nhựa polystyrene tóm bắt kháng thể bám trên giếng nhựa bằng cộng hợp kháng IgG người đánh dấu men peroxidase. Dụng cụ Bộ micopipet: 5 cái với các thể tích hút khác nhau (0 - 5ml; 2 - 20ml; 20 - 200ml; 200 - 1000ml), loại micropipet 8 đầu(20 - 200ml); tủ ấm, tủ sấy, máy ly tâm; đầu eppendorf, tube lấy máu nhiều dung tích Thành phần bộ thuốc thử R1: Bản nhựa polystyren làm ELISA có 96 giếng, với 12 thanh, mỗi thanh 8 giếng đã gắn sẵn kháng nguyên Fasciola spp R2: Dung dịch rữa PBS -T (Photphate buffer saline -Tween 80) R3: Dung dịch pha loãng PBS -T-BSA (BSA: Bovis serum albumin) R4: Cộng hợp là kháng thể kháng IgG gắn men peroxidase (HRPO). R5a: Dung dịch pha đài chất (mono USA Ag-HBs) R5b: đài chất OPD (Ortho-Phenylene-Diamine) hoặc TMB R5c: Dung dịch ngưng phản ứng (acid sunfuaric loãng). R6a: Huyết thanh chứng dương. R6b: Huyết thanh chứng âm. Đọc kết quả ELISA Đọc kết quả bằng mắt thường Chuẩn bị trước khi thực hiện phản ứng Cứ 1 thanh 8 giếng, dùng cho 3 mẫu huyết thanh thử nghiệm, một mẫu chứng dương và một mẫu chứng âm. Cần chuẩn bị: + 50 ml dung dịch rửa PBS -T 1X Pha:2,5 ml R2+47,5 ml nước cất. + 2 ml dung dịch pha loãng PBS -T- BSA 1X Pha:200 ml R3+1800 ml nước cất + 1 ml cộng hợp chứa 1/250 cộng hợp pha trong PBS - T - BSA 1X Pha:4 ml R4+1000 ml PBS -T-BSA 1X + Dung dịch đài chất: chỉ pha ngay trước khi nhỏ vào giếng, không pha trước. Pha:0,4 mg OPD+1 ml dung dịch pha đài chất Hoặc Pha: 80 ml TMB+800 ml dung dịch pha đài chất. Lưu ý: nếu xuất hiện màu chứng tỏ OPD đã bị ẩm. Tiến hành phản ứng Với 1 huyết thanh thử nghiệm chỉ dùng 1/2 thanh gồm 4 giếng ELISA, với 3 huyết thanh thử nghiệm, dùng 1 thanh 8 giếng ELISA. +Pha huyết thanh chứng dương, huyết thanh chứng âm, huyết thanh thử nghiệm 1/20 trong nước muối sinh lý. Pha: 95 ml nước muối sinh lý+5 ml huyết thanh chứng dương. Pha tương tự cho huyết thanh chứng âm và huyết thanh thử nghiệm. +Rửa giếng 5 lần với PBS - T 1X, ngâm 1 phút ở lần cuối (bước 1). + Tiến hành pha loãng các huyết thanh trong các giếng ELISA theo sơ đồ sau: 
Hình 3
+Đậy giếng lại bằng băng keo, ủ ở tủ ấm 37 0Ctrong 1 giờ +Rửa giếng như bước 1. +Cho vào giếng 100 ml cộng hợp, gãi nhẹ ở đáy giếng để trộn đều. Ủ ở tủ âm trong 1 giờ. +Rửa giếng như bước 1. +Cho vào giếng 100 ml dung dịch đài chất, gãi nhẹ để trong tối. Ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 300C trong 5 -15 phút, một khi màu đã phân biệt rõ chứng dương và chứng âm thì làm ngừng phản ứng màu bằng 50ml dung dịch R5c. Đọc kết quả Dựa vào độ đậm nhạt theo chứng (+) thì tùy kinh nghiệm trả lời hiệu giá kháng thể là bao nhiêu. Dương tính được ghi với hiệu giá kháng thể 1/3.200 -1/12.800. Nếu muốn hiệu giá chính xác thì có thể tiến hành pha loãng huyết thanh thử ở độ pha loãng cao hơn. Một số lưu ý: + Vì kháng thể tồn tại kéo dài sau điều trị thành công, nên không tiện dùng ELISA để theo dõi bệnh; + Không có phản ứng chéo với sán lá gan nhỏ, ung thư gan, viêm gan nhưng có phản ứng chéo với một số tác nhân đơn bào amip, sán lá phổi và sán máng. 
Hình ảnh so màu của phản ứng ELISA đọc bằng mắt thường.
Đọc bằng máy (có máy đọc ELISA) Chuẩn bị trước khi thực hiện phản ứng Chuẩn bị 8 mẫu chứng âm, 1 mẫu chứng dương và huyết thanh thử nghiệm. Pha hóa chất tùy theo số lượng huyết thanh thử nghiệm, mỗi một thanh 8 giếng cần chuẩn bị: + 50 ml dung dịch rửa PBS - T 1X Pha:2,5 ml R2+47,5 ml nước cất + 2 ml dung dịch pha loãng PBS - T - BSA 1X Pha:200 ml R3+1800 ml nước cất +1 ml cộng hợp chứa 6/1000 cộng hợp pha trong PBS - T- BSA 1X Pha:6 ml R4+1000 ml PBS -T-BSA 1X +Dung dịch đài chất: chỉ pha ngay trước khi nhỏ vào giếng, không pha trước. Pha:0,4 mg OPD+1 ml dung dịch pha đài chất. HoặcPha:80 ml TMB+800 ml dung dịch pha đài chất. Lưu ý: nếu xuất hiện màu chứng tỏ OPD đã bị ẩm. Tiến hành phản ứng +Sử dụng 1 thanh 8 giếng cho 8 mẫu chứng âm, dùng thanh khác cho huyết thanh chứng dương và huyết thanh thử nghiệm. +Pha huyết thanh chứng dương, huyết thanh chứng âm, huyết thanh thử nghiệm 1/80 trong nước muối sinh lý. Pha:1580 ml nước cất+20 ml huyết thanh chứng (+). Pha tương tự cho huyết thanh chứng (-) và huyết thanh thử nghiệm. +Rửa giếng 5 lần với PBS - T 1X, ngâm 1 phút ở lần cuối (bước 1). +Cho vào mỗi giếng 90 ml PBS - T - BSA 1X +Tiếp tục cho vào mỗi giếng 10 ml huyết thanh chứng (-), huyết thanh chứng (+), huyết thanh thử nghiệm đã pha loãng. +Rửa giếng 5 lần với PBS - T 1X, ngâm 1 phút ở lần cuối (bước 1). +Đậy giếng lại bằng băng keo, ủ ở tủ ấm 37 0C trong trong 1 giờ. +Rửa giếng như bước 1. +Cho vào giếng 100 ml cộng hợp, chạm nhẹ ở đáy giếng để trộn đều; +Ủ ở tủ ấm trong 1 giờ. +Rửa giếng như bước 1. +Cho vào giếng 100 ml dung dịch đài chất, gãi nhẹ để trong tối. Ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 300C trong 5 -15 phút, một khi màu đã phân biệt rõ chứng dương và chứng âm thì làm ngừng phản ứng màu bằng 50 ml dung dịch R5c. Đọc kết quả -Sử dụng kết hợp 2 loại kính lọc với bước sóng 450 nm và 620 nm. -Tùy máy đọc ELISA, có thể đọc theo mật độ quang hoặc đọc theo nồng độ -Đọc theo mật độ quang: +Đọc và ghi kết quả trị số OD của từng giếng +Tính trung bình cộng trị số OD của các mẫu chứng âm và độ lệch chuẩn Ngưỡng dương tính = Trung bình cộng trị số OD âm tính + 3SD
-Đọc theo nồng độ: kết quả dương tính được ghi từ 1/3200 - 1/12.800. Trong nghiên cứu này tôi sử dụng phương pháp đọc theo mật độ quang, độ chính xác phương pháp này cao hơn so với đọc bằng mắt thường.
|
TRANG CHỦ
