 |
| Thực hiện các thao tác xét nghiệm chẩn đoán bằng PCR tại labo Viện Sốt rét KST-CT Quy Nhơn |
Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xét nghiệm và chẩn đoán bệnh trong y học
I. Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR (Polimerase Chain Reaction):
Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 1985. PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.
Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong 1 chu kì:
- Giai đoạn biến tính (denaturation)
- Giai đoạn bắt cặp (annealing)
- Giai đoạn kéo dài (elongaction)
Chu kì này được lặp đi lặp lại từ 20 - 40 lần và cho ra các sản phẩm cuối cùng của PCR là các đoạn DNA hoặc RNA phiên bản. Số lượng các bản sao này được tính theo hàm số mũ: 2 n với n là số chu kì của phản ứng.
Nhờ phát minh kĩ thuật PCR mà ngành sinh học phân tử và nhiều ngành khoa học khác có sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử được tiếp cận với một phương pháp mới đem lại kết quả có ý nghĩa to lớn, trong đó có các nghiên cứu về các lĩnh vực y tế, khoa học đời sống. PCR là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhậy và tính đặc hiệu rất cao; do đó, PCR rất thích hợp cho xét nghiệm chẩn đoán trong lĩnh vực y học.
II. Nguyên lí hoạt động của PCR:
1. Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR ( PCR mix): - Target DNA - Taq. DNA polymerase. - d NTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). - Primer ( oligonucleotide). - PCR buffer. - H20 2. Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân nhiệt (Thermalcycles)
Giai đoạn biến tính (denaturation): 920C - 980C Số lượng bản sao sau n chu kì: 2n ---------- --------- ---------- ---------- --------- III. Một số ứng dụng của PCR trong y học:
1. Phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (HIV, HBV, HCV, M.tuberculosis, leptospira, H.pylory...) có trong các loại bệnh phẩm lâm sàng khác nhau. 2. Chẩn đoán các bệnh ung thư : vú, leukeumia và các loại ung thư khác. 3. Phát hiện các bệnh liên quan đến di truyền. 4. Phát hiện định danh về huyết thống, dấu vân tay, định typ mô học, pháp y... 5. Phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm. 6. Quy trình ứng dụng PCR phát hiện vi sinh vật gây bệnh  | Thực hiện xét nghiệm chẩn đoán bằng PCR |
Các bệnh phẩm y học
¯
Ly trích pre - nucleic acide ¯
Ly trích acide nucleic tinh khiết ¯
PCR ( RT - PCR) ¯
Phân tích phát hiện sản phẩm PCR bằng quang phổ hay điện di
IV. Xử lí bệnh phẩm cho phản ứng PCR
1. Các loại bệnh phẩm có thể sử dụng làm PCR: 1.1. Phát hiện M. tuberculosis: Lao phổi: tốt nhất là đờm (được lấy vào buổi sáng sớm sau khi súc miệng thật sạch với nước muối sinh lý hay nước lọc, tránh lấy quá nhiều bọt). Lao ngoài phổi: lao màng não (dịch não tủy), lao màng phổi (dịch màng phổi), lao màng bụng (dịch màng bụng), lao xương/khớp (dịch hay mủ), lao đường tiết niệu (nước tiểu), lao hạch (chọc dịch hạch), lao màng tim (dịch màng tim). 1.2. Phát hiện HIV, HBV, HCV, KST, Dengue virus: Máu bệnh nhân lúc đói Mẩu sinh thiết mô gan 2. Xử lí bệnh phẩm:
Xử lí với proteinase K và thuốc tẩy rửa |
Ly trích DNA, RNA tinh khiết |
Bệnh phẩm phải đựng trong biopure hay PCR tubeSau khi lấy để ngay ở nhiệt độ 40C hay - 200C Bệnh phẩm phải lấy đúng vị trí, đúng phương pháp và đúng thời gian. V. Ưu điểm và hạn chế của PCR so với xét nghiệm vi sinh vật thông thường: 1. Ưu điểm: PCR | Xét nghiệm trực tiếp | Nuôi cấy | Độ nhậy cảm và đặc hiệu cao | Chưa cao | Chưa cao | Phát hiện được tất cả các loại vi sinh vật dễ dàng | Chỉ phát hiện được ký sinh trùng | Một số vi sinh vật rất khó phát hiện | 1 con VSV cũng phát hiện được | Cần một số lượng lớn | Cần một số lượng lớn | Phát hiện được cả VSV đã chết | Đôi khi | Không phát hiện | Thời gian thực hiện nhanh | Thời gian thực hiện nhanh | Thời gian lâu hơn |
2. Hạn chế: Do tính nhậy cảm và độ đặc hiệu cao nên rất dễ sai lệch kết quả do bị tạp nhiễm. Đòi hỏi trang thiết bị và thao tác kỹ thuật hết sức cẩn thận Giá thành xét nghiệm cao Chỉ định xét nghiệm PCR. 3. Nên chỉ định: Xác định bệnh nhân mang virus Chẩn đoán viêm gan gan tại bệnh viện Điều trị đặc hiệu (interferon) Tác nhân gây bệnh khó có thể phát hiện bằng các xét nghiệm thông thường Theo dõi đáp ứng điều trị mà các phương pháp thông thường khó xác định Các xét nghiệm thông thường không phù hợp với chẩn đoán của bác sĩ 4. Không nên chỉ định: Tác nhân gây bệnh được xác định dễ dàng bằng các xét nghiệm thông thường Tác nhân gây bệnh có thể được bác sĩ chẩn đoán dễ dàng Việc phát hiện tác nhân gây bệnh là không cần thiết
|
TRANG CHỦ
