 |
| Vịt vẫn được chăn thả tự do trên ao hồ |
Nghiên cứu biến đổi thành phần gen H5 của Virus cúm A H5N1 của Vịt An Giang (Việt Nam) và Thế giới
Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, hạt virus (virion) chứa hệ gen RNA một sợi âm (ss-RNA) bao gồm 8 phân đoạn (PA, PB1, PB2, HA, NP, NA, MA, NS), trong đó phân đoạn 4 mã hóa cho protein hemagglutinin (HA) là một protein thụ thể có vai trò bám dính vào tế bào chủ và là kháng nguyên bề mặt chịu trách nhiệm độc lực trong cơ chế gây bệnh của virus. Virus cúm gia cầm có khả năng tái tổ hợp biến chủng để thích nghi và rất dễ thay đổi cấu trúc kháng nguyên (Lê Thanh Hòa và cs, 2004). Cúm gà do virus cúm A/H5N1 xuất hiện ở nước ta từ cuối 2003 và đã có nhiều đợt dịch gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi gia cầm (Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ, 2004). Từ cuối 2005 đến nay, cúm A/H5N1 không còn giới hạn ở châu á, mà đã bùng phát sang châu âu và châu Phi. Do chủng virus có độc lực cao nên tỷ lệ gây chết gần như 100% số gia cầm mắc bệnh và H5N1 đang có nguy cơ tạo thành một đại dịch cúm cho người sau khi virus biến đổi gen hoặc trộn lẫn đặc điểm di truyền với virus cúm thường (Horimoto và Kawaoka, 2001). Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng để thu nhận một phần hoặc toàn bộ gen H5N1, xác định đặc tính sinh học phân tử, định loại subtype, giải trình trình tự, so sánh phân tích số liệu và xem xét di truyền quần thể, tiến hóa nguồn gốc của các biến chủng H5N1 (Wan và cs, 2005; Lê Thanh Hòa, 2006).Khuôn khổ chuyên đề này giới thiệu phân tích biến đổi thành phần gen H5 của một chủng phân lập từ vịt An Giang có đặc tính khác biệt với các chủng của Việt Nam và thế giới. I. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: 1. Nguyên liệu: Bệnh phẩm là dịch khí-phế quản chứa virus cường độc cúm A/H5N1 thu thập từ gia cầm bệnh cuối 2005 tại An Giang (A/Dk/Vietnam/AG/2005(H5N1) gọi tắt là DkAG, đã được vô hoạt bằng nhiệt độ, bảo quản ở -20oC. 2. Các loại sinh phẩm: Bộ kit QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc.) tách chiết RNA hệ gen của virus; Bộ kit one-step RT-PCR của hãng Invitrogen thực hiện phản ứng RT-PCR; Bộ kit QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.); Bộ kit TOPO-TA cloning (Invitrogen) dùng dòng hóa sản phẩm; Chủng vi khuẩn E. coli DHa-T1; Bộ kit QIApreps Spin Miniprep (QIAGEN Inc.) sử dụng tách ADN của các plasmid tái tổ hợp; Bộ kit DyeEx 2.0 Spin Kit (QIAGEN Inc.) dùng tinh sạch phản ứng giải trình tự. 3. Các bước nghiên cứu: Tách ARN hệ gen của virus: ARN hệ gen của virus được tách chiết bằng bộ kit QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng RT-PCR: cặp mồi dùng cho phản ứng RT-PCR thu nhận toàn bộ gen H5: + Mồi xuôi H5BAMF: 5'CGGGATCCTCTGTCAAAATGGAGAAAATAGTGCTT3’, tương ứng vị trí 19-34 trong phân đoạn 4, có bố trí điểm cắt của enzyme giới hạn BamHI (gạch bên dưới); + Mồi ngược H5NOTR: 5’ATAAGAATGCGGCCGCTCATTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACGA3' Tương ứng vị trí 1708-1735 trong phân đoạn 4, có bố trí điểm cắt của enzyme giới hạn NotI (gạch bên dưới). Toàn bộ phân đoạn HA của chủng DkAG có độ dài khoảng 1700 bp được thu nhận bằng phản ứng RT-PCR một bước với cặp mồi H5BAMF - H5NOTR, theo chu trình nhiệt như sau:50oC/60 phút, 95oC/15 phút, 35 chu kỳ [94oC/1phút, 55oC/30 giây, 72oC/2 phút], 72oC/10 phút, sau chu kỳ cuối cùng bảo quản sản phẩm ở 4oC cho đến khi kiểm tra và tinh sạch. Kiểm tra sản phẩm RT-PCR, tinh sạch và dòng hoá sản phẩm vào vector tách dòng: sản phẩm RT-PCR được kiểm tra trên agarose 1%, sau đó được tinh sạch bằng bộ kit QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn. Toàn bộ gen HA trong sản phẩm (khoảng 1,7 kb), sau khi tinh sạch, được dòng hoá vào vector pCR2.1TOPO (Invitrogen). Các phản ứng nối ghép gen, chuyển nạp plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp tạo sốc nhiệt được tiến hành theo đúng quy trình. Vi khuẩn tái tổ hợp được chọn lọc nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oCởtong 16-20 giờ (để qua đêm). Tế bào được thu lại bằng ly tâm và tách chiết ADN plasmid bằng bộ kit QIApreps Spin Mini kit của hãng QIAGEN. Giải trình trình tự và phân tích số liệu: trình tự nucleotide ADN của plasmid được giải trình trên máy tự động ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) có tại Viện Công nghệ sinh học. Chuỗi nucleotide được xử lý bằng chương trình SeqEd1.03, sau đó sử dụng chương trình AsemblyLIGN 1.9 và hệ chương trình MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu các chuỗi bằng chương trình GENEDOC 2.5. Thành phần amino acid được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi khuẩn) trong Ngân hàng gen thông qua chương trình GENEDOC 2.5. Chọn chuỗi so sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide:chuỗi nucleotide gen H5 của chủng virus cúm A/H5N1 ở vịt An Giang của Việt Nam, được truy cập Ngân hàng genđối chiếu với các chủng đã được công bố, sử dụng chương trình BLAST. Các chuỗi H5 của các chủng thế giới đại diện qua các năm (1959-2006) được thu thập và so sánh với H5 của A/H5N1 ở Việt Nam. II.Kết quả nghiên cứu và bàn luận: 1. Kết quả tách RNA tổng số, thu nhận và tách dòng gen H5 RNA tổng số tách chiết bằng bộ kit của hãng QIAGEN cho hàm lượng RNA cao có thể sử dụng làm khuôn để thu nhận các phân đoạn gen của virus. RNA tổng số điện di trên thạch agarose 1% được trình bày ở Hình 1-A.
 | Hình 1: RNA tổng số (A) của virus cúm A/H5N1 chủng DkAG, sản phẩm phân đoạn gen H5 (B) và kết quả tách dòng cắt bằng EcoRI (C) điện di trên thạch agarose 1%. M: Chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể l được cắt bằng HindIII; 1, 2, 3, 4: DNA của plasmid tách dòng, trong đó 1, 2 và 4 là các clone có chứa phân đoạn gen HA (1,7 kb) và clone 3 không có gen H5. |
Phân đoạn HA (gen H5) của virus cúm A chủng DkAG được thu nhận bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu trình nhiệt đã được mô tả. Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1% (Hình 1-B), đó là một băng DNA đặc hiệu, có độ dài khoảng 1,7 kb đúng như dự tính. Sản phẩm được sử dụng cho các thí nghiệm tách dòng tiếp theo.
Sản phẩm RT-PCR của phân đoạn gen HA của chủng DkAG được gắn vào vector tách dòng pCR2.1TOPO để tạo plasmid tái tổ hợp. Các plasmid tái tổ hợp này sẽ được chuyển nạp vào tế bào khả biến (competent cell) chủng E. coli DH-5aT1. Chọn lọc các khuẩn lạc màu trắng có khả năng chứa plasmid tái tổ hợp và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng để thu nhận DNA plasmid. Sau khi tách chiết, các DNA plasmid được cắt bằng enzym giới hạn EcoRI để kiểm tra sự có mặt các đoạn chèn của phân đoạn gen HA. Theo tính toán, nếu vector pCR2.1TOPO tái tổ hợp mang gen HA thì khi cắt bằng EcoRI, sẽ cho 1 đoạn DNA có kích thước khoảng 3,9 kb của vector và 1 đoạn DNA của gen H5 khoảng 1,7 kb (Hình 1-C). Kết quả ở Hình 1-C cho thấy, từ 4 khuẩn lạc đơn dòng được chọn lọc, đã có 3 khuẩn lạc mang đoạn DNA ngoại lai có kích thước khoảng 1,7 kb. Như vậy có thể khẳng định quá trình tách dòng đã lưu giữđược phân đoạn gen HA của chủng DkAG. Sau khi giải trình trình tự và phân tích chuỗi gen, chúng tôi đã thu nhận được gen H5 có độ dài 1707 nucleotide mã hoá cho 568 amino acid.Chuỗi này được truy cậpNgân hàng gen bằng chương trình BLAST, kết quả truy cập được trình bày ở Hình 2. Chủng A/Dk/Vietnam/AG/05(H5N1) có mức độ tương đồng rất cao với các chủng cúm A/H5N1 ở người, chim cút và gà của Việt Nam, như phân tích của một số tác giả khác (Nguyễn Tiến Minh và cs, 2004; Lê Thanh Hoà và cs, 2006).
 | | Hình 2: Kết quả truy cập ngân hàng gen của chủng DkAG với các chủng thế giới. 2. Phân tích biến đổi thành phần gen H5 của virus chủng DkAG của Việt Nam và so sánh với các chủng của thế giới |
Kết quả so sánh đối chiếu thành phần nucleotide và amino acid của toàn bộ gen H5 (1707 bp) chủng A/Dk/Vietnam/AG/2005 với các chủng H5N1 khác phân lập từ vịt của thế giới bao gồm A-Dk-CN-Fujian-05(DQ095629);A-Dk-VN-NCVD08-2005-Tiengiang(ISDN124030);A-Dk-VN-NCVD06-05-Angiang(ISDN124035); A-Dk-Laos-3295-2006(ISDN138780); và 2 chủng cổ điển A-Dk-Gd-173-2004(AY737304) và A-Dk-Gx-13-2004(ISDN48989) được trình bày ở Hình 3.
Hình 3: So sánh thành phần nucleotide và amino acid của chủng A/Dk/Vietnam/AG/2005 với các chủng A/H5N1 phân lập từ vịt của Việt Nam và thế giới. Ghi chú: Phần đóng khung biểu thị sai khác của chủng DkAG với các chủng khác. Có 11 vị trí mà ở đó thành phần nucleotide của gen H5 ở chủng DkAG có sai khác hoàn toàn so với tất cả 6 chủng so sánh. Trong 6 chủng so sánh có 1 chủng từ vịt An Giang và 1 chủng từ vịt Tiền Giang, 1 chủng từ Fujian (Trung Quốc) và 1 chủng từ Lào (mới phân lập), cũng như 2 chủng phân lập từ vịt Quảng Đông và Quảng Tây (Trung Quốc). Sự thay đổi ở 11 vị trí có tính quyết định này, đã làm thay đổi 2 amino acid, rất có thể cũng làm thay đổi tính kháng nguyên của chủng DkAG (Lê Thanh Hoà và cs, 2004). Vùng amino acid tạo nên điểm cắt của protease cũng có khác biệt: chủng DkAG có đầy đủ thành phần RRRKK, một đặc tính quan trọng quyết định độc lực của virus cúm A/H5N1. Trong khi đó, tất cả các chủng còn lại, kể cả 1 chủng khác cũng từ vịt An Giang, không có đầy đủ 5 amino acid nói trên mà chỉ có 4, hoặc thiếu 1 Arginine (R) hoặc thiếu 1 Lysine (K). Sự thiếu hụt này cho phép phán đoán các chủng này có mức độ độc lực không cao như của chủng DkAG. 3. Phân tích mối quan hệ phả hệ của các chủng A/H5N1 từ vịt của Việt Nam Quan hệ phả hệ của các chủng cúm A/H5N1 từ vịt An Giang và Tiền Giang được phân tích so sánh với các chủng khác, kết quả trình bày ở Hình 4. Các chủng của Việt Nam bao gồmchủng A/Dk/Vietnam/AG/2005 đang nghiên cứu, chủng A-Dk-VN-NCVD08-2005-Tiengiang(ISDN124030); A-Dk-VN-NCVD06-05-Angiang(ISDN124035) cùng hợp nhất trong một nhóm với chủng A-Dk-Gd-173-2004(AY737304) có nguồn gốc từ Quảng Đông (Trung Quốc), trong khi các chủng của Lào (A-Dk-Laos-3295-2006(ISDN138780)), Phúc Kiến-Trung Quốc (A-Dk-CN-Fujian-05(DQ095629)) và Quảng Tây-Trung Quốc (A-Dk-Gx-13-2004(ISDN48989)) tập hợp cùng với nhau. Điều này cho phép nhận xét, có thể chủng A/Dk/Vietnam/AG/2005 xuất phát từ Quảng Đông, còn chủng A-Dk-Laos-3295-2006(ISDN138780) của Lào có nguồn gốc từ Quảng Tây.  | | Hình 4. Phân tích phả hệ của các chủng A/H5N1 từ vịt của Việt Nam và một số chủng khác trong vùng Châu Á. |
III. Kết luận: Toàn bộ chuỗi gen H5 của chủng A/H5N1 phân lập từ vịt An Giang có độ dài 1707 bp đã được thu nhận và giải mã thành công. Chuỗi gen H5 của chủng DkAG (Việt Nam) có 11 vị trí sai khác hoàn toàn so với 6 chủng so sánh trong đó có 2 chủng Việt Nam, 1 chủng Lào va 3 chủng Trung Quốc. Chủng DkAG có đầy đủ RRRKK tại vị trí cắt của protease có tính quyết định về độc lực cao (HPAI) trong khi các chủng còn lại chỉ có 4 amino acid. Chủng A/Dk/Vietnam/AG/2005 có nguồn gốc từ Quảng Đông qua kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ.
|
TRANG CHỦ
