|
Nghiên cứu ứng dụng quan kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán và phát hiện các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm
Kỹ thuật hay phương pháp chẩn đoán, phát hiện dựa trên LAMP (là viết tắt của từ “Loop-Mediated Isothermal Amplification” có nghĩa là sự khuếch đại ADN ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng hay móc. LAMP được phát triển đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm tác giả T. Notomi (Nhật Bản). Đây là một phương pháp khuếch đại ADN có tính đặc hiệu, hiệu quả cao và thời gian ngắn, bằng cách tận dụng ưu điểm của khuếch đại chuỗi Bst và một loạt 4 mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện toàn bộ 6 trình tự cách xa nhau trên ADN đích. Dù mới được giới thiệu ra mắt gần 20 năm nhưng LAMP cũng đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực như phát hiện, chẩn đoán các mầm bệnh trên người và trên lĩnh vực y tế thú y khác, cũng như công nghiệp thực phẩm, môi trường. LAMP là một phương pháp khuếch đại gen tiềm năng có nhiều hứa hẹn nếu tiếp tục được nghiên cứu và thử nghiệm để áp dụng vào những hướng nghiên cứu mới giờ đây và trong tương lai. NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT LAMP Phương pháp này dựa trên sự tổng hợp ADN thay thế chuỗi tự xoay vòng được thực hiện bởi một DNA polymerase và hai cặp mồi trong và mồi ngoài được thiết kế đặc biệt. Ở các bước đầu của phản ứng LAMP cả 4 mồi được sử dụng, nhưng sau đó trong suốt phản ứng chu kỳ chỉ các mồi trong được sử dụng để tổng hợp ADN thay thế chuỗi. Cặp mồi trong gồm 2 mồi là mồi xuôi (forward inner primer- FIP), và mồi ngược (backward inner primer- BIP) và mỗi một mồi có chứa hai trình tự riêng biệt tương ứng với trình tự sense và antisense của ADN đích. Trình tự FIP và BIP sẽ được thiết kế như sau: +FIP chứa F1c, một đoạn TTTT và một trình tự F2 bổ sung với F2c. +BIP sẽ chứa trình tự B1c bổ sung cho B1, một đoạn TTTT và B2. +Hai mồi bên ngoài là B3 bổ sung cho đoạn B3c và trình tự F3 bổ sung cho F3c. Để khởi động phản ứng LAMP, Bst DNA polymerase được sử dụng và ủ ở nhiệt độ 60-65°C trong 1 giờ. Khi gen mục tiêu và các nhân tố cần thiết được ủ ở nhiệt độ không đổi, các bước phản ứng xảy ra ban đầu như sau: Nguyên liệu ban đầu là sợi đôi ADN chứa gen mục tiêu + Bước 1: mồi xuôi FIP chứa trình tự F2 sẽ bổ sung vào mạch ADN ở vị trí F2c; + Bước 2: DNA polymerase thực hiện kéo dài sợi ADN mới từ mồi FIP; + Bước 3: mồi ngoài F3 bổ sung vào F3c và được kéo dài. Sự tổng hợp sợi ADN mới bởi mồi này và DNA polymerase dẫn đến giải phòng sợi ADN tổng hợp từ mồi FIP; + Bước 4: sợi đôi ADN được hình thành từ sợi khuôn và mồi F3; + Bước 5: sợi đơn ADN được tổng hợp từ mồi FIP và khuôn được giải phóng. Vì đầu 5’ của sợi này có chứa 2 trình tự bổ sung nhau là F1c và F1 nên hình thành cấu trúc vòng; + Bước 6: sợi ADN được tạo ra từ bước 5 sẽ làm khuôn cho mồi BIP tổng hợp sợi mới và mồi B3 sẽ có chức năng như F3 là tổng hợp sợi mới và giải phóng sợi ADN mồi BIP. + Bước 7: sợi đôi ADN được hình thành từ mồi B3 và sợi được tổng hợp từ bước 5; + Bước 8: sợi ADN được tổng hợp từ mồi BIP và sợi chứa mồi FIP sẽ hình thành cấu trúc vòng ở 2 đầu do sự bổ sung của 2 cặp trình tự với nhau. Để khởi đầu cho chu kì phản ứng LAMP, FIP bắt cặp bổ sung với ADN đầu vòng ở vị trí F2c để tiến hành tổng hợp mạch bổ sung thay thế. Mặt khác, BIP sẽ bổ sung vào đầu kia của mạch ADN đầu vòng và xảy ra quá trình tổng hợp ADN tương tự. Kết quả của phản ứng là hỗn hợp các sợi đôi ADN chứa nhiều trình tự ADN mục tiêu với kích thước khác nhau. Đánh giá kết quả của LAMP + Đánh giá kết quả bằng điện di: LAMP có thể được đánh giá kết quả bằng điện di. Kết quả dương tính sẽ cho một vạch smear dài + Đánh giá kết quả không bằng điện di: Do lượng sản phẩm của phản ứng LAMP rất lớn nên ta có thể quan sát bằng mắt thường nếu có một số hóa chất nhuộm thích hợp; Kết quả phản ứng LAMP được đánh giá thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứng mà không cần điện di. Khi ADN đích được khuếch đại bởi LAMP, một chất kết tủa trắng bắt nguồn từ magnesium pyrophosphate (một sản phẩm phụ của phản ứng LAMP) sẽ xuất hiện. Có thể quan sát và so sánh độ đục với mẫu âm tính (đục hơn là dương tính), hoặc tiến hành đo độ hấp thụ ở 650nm (nếu đạt đến 0,1 là dương tính). Một phương pháp khác là mẫu ADN sau khi chạy LAMP sẽ được bổ sung SYBR Green I, ethidium bromide hay Fluorescent. Rồi quan sát dưới đèn UV. Kết quả dương tính có hiện màu đặc trưng hay phát sáng 
Hình 1: Đánh giá kết quả LAMP.
a, dưới đèn UV. b, dưới ánh sáng thường. c, kết quả LAMP bằng điện di.
Quy trình thực hiện LAMP 
Hình 2: Quy trình thực hiện LAMP
Tính ưu việt của kỹ thuật LAMP so với PCR -LAMP là một phương pháp khuếch đại ADN mới, có độ đặc hiệu cao, bằng cách tận dụng ưu điểm của Bst Polymerase và một bộ 4 mồi được thiết kế đặc biệt để nhận ra từ 2- 6 trình tự cách xa nhau trên gen đích, do vậy làm tăng độ nhạy cũng như độ nhanh của phản ứng; -Thời gian thực hiện LAMP nhanh hơn so với PCR. Theo đó, thời gian thực hiện PCR trung bình khoảng 2,5-3 giờ, trong khi thời gian thực hiện LAMP trung bình khoảng 1-1,5 giờ. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc chẩn đoán và xác định bệnh nhanh ở động vật, đặc biệt là trên người; -Kết quả của phản ứng LAMP có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia UV; -Hệ thống LAMP không yêu cầu nhiều thiết bị như máy luân nhiệt và chu trình nhiệt. Hơn nữa, hệ thống này không cần đến năng lượng điện (vì có thể sử dụng túi ấm hoặc túi giữ nhiệt). Do đó, có thể giảm được thời gian vận chuyển, phát hiện nhanh, có tính di động và hiệu quả kinh tế cao. Phù hợp với những vùng đang còn thiếu thốn về cơ sở hạ tầng cũng như yếu kém về khoa học công nghệ như ở các tỉnh miền núi phía Bắc nước ta. Các thiết bi chính để thực hiện kỹ thuật LAMP -Tủ an toàn sinh học cấp II -Máy ly tâm, spin down -Máy vortex -Máy chụp gel -Hệ thống điện di -Máy ổn nhiệt -Bộ micropipettes -Tube 0,2ml; 2ml; đầu côn các loại -Hộp đá, đá giữ lạnh hóa chất, sinh phẩm LAMP: Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian cấu trúc kẹp tóc -LAMP là một phương pháp khuếch đại acid nucleic với độ nhạy rất cao và độ đặc hiệu để phân biệt sự khác nhau của nucleotid mạch đơn; -LAMP được đặc trưng bởi việc chỉ sử dụng một DNA polymerase có độ nhạy thấp để ức chế và một bộ bốn đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận biết sáu trình tự khác nhau trên gen mục tiêu. Khuếch đại chỉ xảy ra khi tất cả mồi bám được vào khuôn, do đó tạo thành một sản phẩm; -LAMP là một kỹ thuật mà có thể khuếch đại một vài bản của vật liệu di truyền lên 109 bản trong vòng dưới 1 tiếng đồng hồ; -LAMP là một kỹ thuật cho phép khuếch đại DNA với độ đặc hiệu cao, độ nhạy và nhanh chóng dưới điều kiện đẳng nhiệt. Vì vậy nó có thể được thực hiện bằng cách sử dụng máy ấp trứng đơn giản (bồn tắm hoặc lò sưởi); -Yêu cầu đơn giản như vậy làm cho các phòng thí nghiệm nhỏ, đặc biệt là ở khu vực nông thôn địa phương cũng có thể dễ dàng tiến hành LAMP, do đó, nó có vẻ là một công cụ đầy hứa hẹn; -Tính năng độc đáo này không chỉ cho kết quả ở sản lượng cao hơn, nhưng nó cũng cắt giảm việc sử dụng các chu trình nhiệt và chu kỳ dài của những nhiệt độ khác nhau, tiết kiệm thời gian và nhiên liệu bởi sự luân nhiệt. Ngoài ra, một lượng lớn pyrophosphate magiê màu trắng được kết tủa từ qaúa trình khuếch đại DNA; -Độ đục của phản ứng này tỷ lệ thuận với số lượng DNA tổng hợp. Kết quả là, có thể để đánh giá phản ứng trong thời gian thực bằng cách đo độ đục hay, quan trọng hơn, bởi trực quan bằng mắt thường, tạo điều kiện phân biệt tốt hơn các mẫu dương tính và âm tính. Phương pháp LAMP có thể tổng hợp 20 mg DNA cụ thể từ 25 ml hỗn hợp phản ứng trong một giờ; -LAMP đã được sử dụng thành công để phát hiện nhanh chóng của DNA và RNA virus như virus West Nile, hội chứng hô hấp cấp tính nặng (SARS), và sốt xuất huyết. Gần đây, ngành ký sinh trùng học đã thích nghi với kỹ thuật LAMP để phát hiện một số bệnh ký sinh trùng, bao gồm cả các loài ký sinh trên người ký sinh trùng đường ruột (Cryptosporidium), amip (Entamoeba histolytica), ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium), đơn bào Trypanosoma, sán dây Taenia, sán máng Schistosoma, sán lá gan lớn Fasciola hepatica và Fasciola gigantica và đơn bào Toxoplasma gondii, và ký sinh trên động vật như Theileria và Babesia. Thậm chí muỗi mang ký sinh trùng Plasmodium sp. và Dirofilaria immitis đã được xác định nhờ sử dụng kỹ thuật này. Ngoài ra, kỹ thuật này có thể phát hiện trùng lông sau ngày đầu tiên tiếp xúc trong ốc, các chủ trung gian của Schistosoma sp. Nkouawa và cộng sự tiến hành so sánh LAMP với phản ứng multiplex PCR trong việc phát hiện khác biệt của Taenia trong mẫu phân của bệnh nhân với bệnh sán dây. LAMP không có dương tính giả -Tavares RG và cộng sự đã cho biết. Kỹ thuật phân tử để nghiên cứu và chẩn đoán ký sinh trùng nhiễm có độ nhạy cao hơn (88,4%) so với phản ứng multiplex PCR (37,2%), thể hiện một giá trị cao trong việc phát hiện bệnh sán dây bằng phương pháp phân tử. Ai và cộng sự đã thực hiện phân tích DNA của Fasciola sp. trong động vật thân mềm là vật chủ trung gian và trong các mẫu phân. Kết quả cho thấy các xét nghiệm LAMP nhạy cảm hơn so với khoảng 10 lần so với phương pháp cụ thể thông thường chẳng hạn như PCR. Những phát hiện này cho thấy rằng phương pháp LAMP cho loài cụ thể có thể có một ứng dụng lâm sàng tiềm năng để phát hiện và phân biệt các loài Fasciola, đặc biệt là ở các quốc gia có bệnh địa phương. Theo một nghiên cứu của Lau và cộng sự, LAMP có thể phát hiện Toxoplasma gondii trong máu của người với độ nhạy vượt 85%, cao hơn so sử dụng nested-PCR (62,5%), với tất cả mẫu của cả hai phương pháp là 100% đặc hiệu. Vì tính đơn giản, độ nhạy, độ đặc hiệu, LAMP được đề xuất như một phương pháp thích hợp cho việc chẩn đoán thường xuyên sự nhiễm trùng ở người. Một nghiên cứu của Njiru và cộng sự đã chứng minh rằng phản ứng LAMP có thể đạt được mà không cần trích xuất ADN từ các mẫu. Các tác giả tìm thấy một trình tự được bảo tồn trong các yếu tố di động chèn lặp lại (repetitive insertion mobile element -RIME) của phân chi Trypanozoon và sử dụng nó để phát triển mồi cho một thử nghiệm LAMP rất cụ thể. Trong 35 phút, sử dụng một cốc nước đơn giản, RIME LAMP đã có thể phát hiện Trypanosoma brucei gambiense và Trypanosoma brucei rhodesiense trực tiếp từ máu, huyết thanh và dịch não tủy (CSF). Trong một nghiên cứu của Matovu và cộng sự cho thấy RIME LAMP nhạy hơn PCR cách đáng kể trong chẩn đoán các loài Trypanosoma nói trên. Hơn nữa, phương pháp LAMP có thể được áp dụng cho các lĩnh vực khác của ký sinh trùng học, phản ứng LAMP mở rộng khác được thiết kế để đáp ứng nhu cầu phát hiện cụ thể. Ví dụ, trong một nghiên cứu của Babesia trâu, bò, một LAMP multiplex (mLAMP) phương pháp được phát triển đồng thời phát hiện B. bovis và B. bigemina trong DNA chiết xuất từ máu vào giấy lọc. Tương tự như vậy, Han và cộng sự. thực hiện một thử nghiệm LAMP dựa trên gen 18S rRNA để phát hiện bốn loài ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium) nhiễm trên người (P. falciparum, P. vivax, P. malariae và P. ovale), không có DNA phản ứng chéo. So với nested-PCR, LAMP có độ nhạy tương tự, độ đặc hiệu cao hơn và thời gian phản ứng nhanh hơn. Kết quả của họ phù hợp với các nghiên cứu khác chứng minh sự cải thiện về tốc độ, độ nhạy và độ đặc hiệu thu được bằng cách sử dụng thử nghiệm LAMP. Phát triển kỹ thuật LAMP (loop-mediated isothermal amplification) cho việc phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Escherichia coli O157: H7 Nhóm nghiên cứu của các tác giả từ Đại học Sư phạm Thái Nguyên và Viện Công nghệ sinh học cho thấy khi nghiên cứu LAMP. Vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 là nguyên nhân quan trọng gây nên các vụ ngộ độc thực phẩm và gây chết người trên toàn thế giới. Một kỹ thuật phát hiện nhanh và chính xác là rất quan trọng. Shiga toxin 2 (mã hóa bởi gen stx2) là một tác nhân quan trọng gây của dòng STEC nói chung và E. coli O157:H7 nói riêng, do vậy gen st2 là một trong những gen đích cho rất nhiều các kỹ thuật phát hiện sử dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển kỹ thuật LAMP để phát hiện nhanh và chính xác chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7. Kỹ thuật này có ưu điểm là phát hiện nhanh, chính xác và thiết bị đơn giản.Bộ mồi được thiết kế đặc biệt dựa trên trình tự genstx2.Chúng tôi nhận thấy không có sự khác nhau khi sử dụng duy nhất mồi trong (BIP/FIP) hoặc cả 4 mồi. Phản ứng dương tính được quan sát bằng mắt thường khi sử dụng SYBR green hoặc dưới tia UV.
Escherichia coli O157:H7(E.coli O157:H7) thuộc nhóm vi khuẩn tạo độc tố Shiga(Shigatoxin-producing Escherichiacoli,STEC). Vi khuẩn E. coli O157:H7 là một trong những nguyên nhân chính nên các vụ ngộ độc thực phẩm và một số bệnh ở người như: tiêu chảy, viêm ruột, hội chứng sưng huyết và suy thận(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS). Theo Rasekh và cộng sự (2005), có khoảng 1,8 triệu người chết vì hội chứng sưng huyết trong khi số người tử vong do ngộ độc thực phẩm chưa thống kê được. Việc phát hiện nhanh E. coli gây bệnh là rất quan trọng,vì vậy,một phương pháp phát hiện chính xác và hiệu quả là rất cần thiết. Hiện nay, việc phát hiện nhân tố gây bệnh thường dựa trên cơ chế và độc tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn. Kỹ thuật LAMP là phương pháp nhân bản DNA nhanh được phát triển bởi Notomi và cộng sự (2000), kỹ thuật này được ứng dụng để phát hiện virus,vi khuẩn,nấm và ký sinh vật. Phương pháp này yêu cầu một bộ mồi đặc biệt để nhận ra từ 2-6 vùng trêngen đích,do vậy làm tăng độ nhạy cũng như độ nhanh của phản ứng. Kết quả của phản ứng LAMP có thể được quan sát bằng mắt thường hay bằng điện di trên gel agarose hoặc thêm thuốc nhuộm phát quang dưới tia UV. Kỹ thuật LAMP được thực hiện trong điều kiệu đẳng nhiệt vì vậy, chỉ cần sử dụng các thiết bị giữ nhiệt như bể ổn nhiệt, tủ ấm. Hơn nữa,thành phần phản ứng có thể bảo tồn trongmột tháng khi giữ ở nhiệt độ 37oC tốt hơn đề xuất của nhà sản xuất [7]. Với những ưu điểm đó, kỹ thuật LAMP trở thành kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong các phương pháp phát hiện nhanh và chính xác. Đã có một vài nghiên cứu kỹ thuật LAMP để phát hiện vi khuẩn E. coliO157:H7 và một số vi khuẩn độc mang gen stx2 được nghiên cứu trên thế giới [1,3,8]. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào được công bố. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật LAMP cho việc phát hiện nhanh và chính xác chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 tại Việt Nam nhằm tạo tiền đề cho việc phát triển kit thử nhanh vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thực phẩm cũng như các mẫu nghiên cứu khác. Vi khuẩn E. coli O157:H7, chủng này được cung cấp từ bộ môn Vi sinh vật, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Enzyme Bstpolymerase, đệm, dNTP của hãng Biolabs; các cặp mồi được đặt của invitrogen tổng hợp. Các cặp mồi:VT2BIP(469-489):5'-TGCTCTGGATGCATCTCTGGTCATATCTG GTTTCATCATATCTGGCG-3'; VT2FIP (588-608):5'-GCGTTTTGTCACTGTCACAGCAG ATAGCCTGACGAAATTCTCTCTGT-3';B1c (514-537):5’-TGCTCTGGATGCATCTCTGG TCAT-3'; F1c (543-566): 5'-GCGTTTTGTCAC TGTCACAGCAGA-3'. Các cặp mồi chúng tôi sử dụng theo thiết kết của Maruyama và cộng sự (2003). Phương pháp tách DNA tổng số của vi khuẩn được tiến hành theo phương pháp của Sambrook & Rusell (2001). Thành phần phản ứng LAMP như sau: đệm (10X): 2,5 µl, dNTP (10mM): 2,5 µl, mồi BIP (10pmol/µl):0,8µl,mồi FIP (10pmol/µl): 0,8µl, BstDNApolymerase (5u/µl):0,2µl, DNAtemplate (6µg/ml):1µl,H2O:17,2µl. Chu trình nhiệt như sau: 94độC trong 5 phút; 63độC trong 60 phút, 80độC trong 10 phút. Thông thường, bộ mồi của kỹ thuật LAMP gồm từ 4-6 cặp mồi. Bộ mồi gồm có một cặp mồi dùng tách dòng gen, một bộ mồi trong và một bộ mồi ngoài. Những cặp mồi này thường được thiết kế dựa trên phần mềm PrimerExplorerV4. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Maruyama (2003) số bộ mồi tối thiểu là 1 cặp gồm cặp mồi BIP/FIP.Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ mồi theo nghiên cứu của Maruyama nhằm làm sáng tỏ thêm vấn đề này. Tách chiết DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn. Tiến hành tách chiết cả DNA tổng số và DNA plasmid, tuy nhiên, khi sử dụng DNA plasmid làm mẫu thì phản ứng không xảy ra. Vì vậy, mẫu chúng tôi sử dụng là DNA tổng số. Cùng với vi khuẩn E. coli O157:H7, sử dụng vi khuẩn E. coli ATCC làm đối chứng âm. DNA tổng số của hai chủng được tách theo phương pháp của Sambrook và Russel mô tả có cải biến. Sau đó, DNA tổng số được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện trên hình. Qua hình 2 ta thấy chỉ xuất hiện 1 băng sáng và rõ chứng tỏ DNA tổng số được tách chiết từ vi khuẩn E. coli O157:H7 và ATCC có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Phản ứng LAMP: Trước khi tiến hành phản ứng, DNA mẫu được biến tính ở 94độC trong thời gian 5phút, sau đó đặt trên đá 3 phút rồi bổ sung thêm enzyme Bst polymerase. Phản ứng được tiếp tục ở 630C trong thời gian từ 30 giây đến 1 giờ. Kết quả cho thấy phản ứng LAMP cho kết quả dương tính với vi khuẩn E.coli O157:H7, âm tính với vi khuẩn E.coli ATCC (hình3). Mặt khác kết quả cho tương đồng khi sử dụng bể ổn nhiệt hay máy PCR (kết quả không được thể hiện). Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra 2 phản ứng song song. Một phản ứng chỉ gồm cặp mồi BIP/FIP và một phản ứng gồm 2 cặp mồi BIP/FIP và cặp mồi loop. Sản phẩm sau có được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả cho thấykhông có sự khác nhau giữa hai phản ứng này (hình 3). Phát hiện sản phẩm LAMP Cách đơngiản nhất để phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP điện di trên gelagarose 1%. Theo lý thuyết, kết quả phản ứng sẽ cho nhiều băng có kích thước khác nhau được điện di trên gel agarose. Kết quả nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với lý thuyết. Tương tự như điện di, chúng tôi thêm trực tiếp EtBr vào 2 ống thử phản ứng, sau đó soi dưới tia UV. Những mẫu dương tính sẽ phát quang, còn những ống âm tính độ sáng sẽ kém hơn (do còn DNA mẫu và DNA mồi) (Kết quả không được thể hiện trên hình). Một cách phát hiện sản phẩm LAMP bằng mắt thường là sử dụng SYBR GreenI. Phản ứng sau khi diễn ra, chúng tôi bổ sung thêm 1% SYBRGreenI. Những mẫu nào dương tính sẽ cho màu xanh, còn mẫu nào âm tính sẽ cho màu vàng chanh. Như vậy, phản ứng LAMP hoàn toàn có thể xảy ra khi chỉ sử dụng duy nhất một cặp mồi BIP/FIP. Phương pháp này có thời gian tiến hành phân tích kết quả nhanh và chính xác, trong khi đó kỹ thuật, hóa chất và thiết bị đơn giản, vì vậy, có thể thấy đây là một trong những hướng tạo kít phát hiện nhanh trong điều kiện làm việc chưa được tốt như ở Việt Nam hiện nay. Phương pháp RT-LAMP đã được thiết lập đểphát hiện virus Dengue. Phương pháp này rất đơn giản và nhanh, sản phẩm của phản ứng RT-LAMP có thể được xác định sau 60 phút phản ứng ở một điều kiện nhiệt độ là 61độC. Một số điều kiện tối ưu cho phản ứng RT-LAMP dùng để khuếch đại RNA virus Dengue đã được xác định như nhiệt độ (610C), thời gian phản ứng (60 phút), nồng độ dNTPs (0,4 mM), ion Mg2+(6 mM), betaine (0 M). Sản phẩm phản ứng RTLAMP có thể được xác định nhanh và đơn giản bằng cách bổsung MgSO4 và ethidium bromide sau đó soi dưới đèn UV. Phản ứng RT-LAMP thiết lập trong nghiên cứu đã được thử nghiệm để phát hiện virus Dengue trực tiếp từ huyết thanh bệnh nhân. Phản ứng chéo với virus sởi và rubella của phương pháp RT-LAMP cũng đã được kiểm tra. Những kết quả này cho thấy rằng phương pháp RT-LAMP có thể được ứng dụng để phát hiện virus Dengue và phù hợp với những cơsở có trang thiết bị còn hạn chế.
|
TRANG CHỦ
