Vien Sot ret Ky Sinh Trung - Con trung Quy Nhon

Độc lực của chủng E. histolytica được phân lập từ bệnh nhân không triệu chứng hoặc có triệu chứng, tính đa dạng di truyền

Nhiễm ký sinh trùng đơn bào E. histolytica thường không có triệu chứng, chỉ một phần nhỏ những người bị nhiễm sẽ phát triển thành bệnh lỵ và trong một số ít trường hợp, xuất hiện áp xe gan. Ở những khu vực lưu hành bệnh lỵamíp, tỷ lệ mắc mớiE. histolytica được phát hiện cao hơn loài E. dispar, trong khi quần thể dân cư không bị bệnh lỵ amíp. Chẩn đoán phân tử ở những người mang mầm bệnh không triệu chứng cho thấy một số lượng đáng kể các trường hợp nhiễm phối hợp với Entamoebaspp. hoặc có liên quan đến một loài đơn bào khác. Tuy nhiên, sự đồng vận (synergy) có thể có giữa các quần thể loài hỗn hợp thúc đẩy độc lực của E. histolytica vẫn chưa được nghiên cứu; chủ yếu là do không thể tiến hành các thí nghiệm thực địa với những ký sinh trùng này trên người. Tuy nhiên, giả thuyết này là hợp lý vì như đã đề cập ở trên, sự hiện diện các loài đơn bào khác nhau ở cùng một cá thể dẫn đến những thay đổi trong hệ vi sinh vật và có khả năng, sự tương tác giữa các loài amíp có thể thay đổi các thông số của chu kỳ sinh học; ví dụ, bằng cách gây ra sự tập hợp hiệu quả của thể hoạt động vì nhiều phân tử trên bề mặt amíp là giống nhau giữa các loài khác nhau.

Kiến thức liên quan về độc lực amíp đã được tiếp nhận bằng cách nghiên cứu các chủng E. histolytica được phân lập ở các khu vực địa lý khác nhau: Trong khi chủng HM1: IMSS được phân lập ở Mexico từ một bệnh nhân bị amíp, có độc lực; chủng Rahman được phân lập ở Anh từ một người mang trùng không triệu chứng, có độc lực yếu đi tự nhiên và cho thấy độc lực giảm trong các mô hình thí nghiệm. Các phân lập E. histolytica với các kiểu độc lực khác nhau cũng đã được báo cáo ở các quốc gia khác. Để giải mã các cơ chế hỗ trợ các mức độ độc lực khác nhau giữa các chủng, người ta đã so sánh các kiểu gen ký sinh trùng để xác định những thay đổi về đa hình di truyền (ví dụ: sử dụng các chỉ điểm đa hình liên quan đến tRNA hoặc các yếu tố có thể chuyển vị ngược (retrotransposable elements) hạt nhân xen kẽ). Dữ liệu cho thấy tính đa dạng di truyền cao ở các chủng E. histolytica được phân lập trên toàn thế giới, nhưng mối liên hệ của chúng với kết quả của nhiễm trùng vẫn còn khó nắm bắt.

Việc giải trình tự toàn bộ gen của thể hoạt động phân lập từ các mẫu trên toàn cầuđã xác định tính đa hình đơn nucleotide đơn (SNP) trong các chủng này. Mặc dù sự khác nhau của chúng so với bộ gen tham chiếu là nhỏ (giữa 0,312 và 0,857 SNP trên mỗi kilobase), các SNP cho thấy tính đàn hồi của bộ gen và cho thấy sự tái tổ hợp gen trong Entamoebaspp. Để kiểm tra mối liên quan tiềm ẩn giữa SNP và kết quả bệnh, các mẫu phân của người và dịch hút từ áp xe gan được thu thập từ các khu vực lưu hành bệnh lỵ amíp. Sau nuôi cấy ký sinh trùng xenic (nuôi cấy ký sinh trùng với những vi sinh vật chưa biết) ngắn ngày, giải trình tự DNA và phân tích tin sinh học rộng rãi đã xác định được các SNP từ 21 vị trí gen. Hai gen (EHI_065250 và EHI_080100) có các SNP có liên quan rất lớn đến ký sinh trùng được phân lập từ áp xe gan.

Gần đây, các SNP ở các vị trí gen không lặp lại, vốn có tính ổn định di truyền đã được xác định trong 49 phân lập E. histolytica từ người có kết quả bệnh khác nhau (22 trường hợp tiêu chảy, 7 trường hợp không triệu chứng và 20 trường hợp áp xe gan). Tổng cộng có 26 SNP có mặt trong ba trình tự DNA mã hóa (gen protein giàu lysine và axit glutamic, kerp1, EHI_098210; gen protein 2 giàu axit glutamic và lysine, kerp2, EHI5A_120210 và gen amoebapore C, apc, X76903), và trong hai trình tự không mã hóa (intron AY956435, vùng liên gen AY956439). Phân tích phân bố di truyền trong gen kerp2 cho thấy 10 SNP liên quan đến các nhóm kết quả bệnh (7 không triệu chứng, 2 áp xe gan). Các mối tương quan giữa SNP-bệnh này, cùng với các sự kiện tái tổ hợp tiềm ẩn và sự phân biệt đáng kể về quần thể giữa các chủng gây bệnh và không gây bệnh của E. histolytica, cho thấy các SNP có thể chịu áp lực chọn lọc liên tục từ vật chủ và có thể là yếu tố quyết định tiềm năngđối với kết quả quá trình nhiễmbệnh lỵ amíp.

Các SNP của gen kerp2 là những SNP đầu tiên được gợi ý là các chỉ điểm dự báo tiềm năng liên quan đến nguy cơ cao phát triển áp xe gan ở những người bị nhiễm E. histolytica không triệu chứng dai dẳng. Nhìn chung, những dữ liệu đáng khích lệ này, cho thấy tác động của sự đa dạng di truyền của các phân lập thực địa của E. histolytica đến kết quả của bệnh, kêu gọi cần có thêm các nghiên cứu, với phạm vi lấy mẫu lớn, ở các khu vực địa lý khác nhau nơi bệnh lỵ amíp lưu hành, để có được các chỉ điểm di truyền có liên quan đến việc phát hiện các chủng E. histolytica có khả năng xâm nhập vào nhu mô ruột.

Entamoeba histolytica và con người: Từ kiểu hình không triệu chứng đến có triệu chứng

Sự cân bằng phức tạp giữa kiểu hình giống hội sinh và gây bệnh của E. histolytica đã cho phép ký sinh trùng này trở thành một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất ở người, gây ra nhiễm trùng đe dọa đến tính mạng. Là một ký sinh trùng gây bệnh, E. histolytica gây tình trạng lỵ amíp ở khoảng 10% số người nhiễm. Vì vẫn chưa được hiểu rõ, thể hoạt động bắt đầu phá hủy hàng rào niêm mạc-biểu mô, nên gây ra sản xuất quá mức chất nhầy, tiêu diệt tế bào vật chủ và gây viêm ruột và kiết lỵ. Thể hoạt động có thể phân tán qua hệ thống tĩnh mạch cửa và xâm nhập vào gan, nơi chúng tạo thành áp-xe.

Các giai đoạn của bệnh lỵamíp này, biểu thị cho độc lực của amíp, phụ thuộc vào khả năng thích nghi nhanh chóng của ký sinh trùng với các môi trường mới mà nó gặp phải (chất nhầy, biểu mô, máu). Một phản ứng miễn dịch hiệu quả đối với sự xâm nhập của ký sinh trùng sẽ dẫn đến sự tiêu diệt thể hoạt động vì trên thực tế chúng không thể tạo nang ngoài lòng ruột. Thể hoạt động xâm lấn kích hoạt khả năng gây bệnhđều có đặc điểm liên quan đến một số yếu tố ký sinh trùng, gồm các chỉ điểm chosự bám dính vào tế bào động vật có vú, khả năng vận động, phân hủy cơ chất ngoại bào (extracellular matrix - ECM), đầu độc tế bào và vùi (engulfment) các tế bào người, gây chết tế bào vật chủ và viêm.

Entamoeba histolytica: Thể tư dưỡng hoạt động gây bệnh và các protein sốc nhiệt

Độc lực của amíp thường được xét đến là khả năng của ký sinh trùng tạo ra áp-xe gan ở các động vật thí nghiệm dễ nhạy cảm (chuột nhảy và chuột hamster). Tuy nhiên, việc nuôi cấy Entamoeba histolytica HM-1: IMSS lâu dài dẫn đến mất đi kiểu hình gây bệnh và không thể đảo ngược quá trình đó. Lý do khiến độc lực của thể hoạt động giảm có thể là do nhiều yếu tố. Đến nay, một số nghiên cứu đã nhấn mạnh mối tương quan giữa sự giảm độc lực và việc amíp không duy trì được môi trường thiếu oxy nội bào do đáp ứng vớistress oxy hóa (OS) của chúng giảm. Hơn nữa, dòng chảy đường phân giảm không hồi phục ở thể hoạt động giảm độc lực khi tiếp xúc với O₂, củng cố thêm ý tưởng về mối liên hệ giữa độc lực và cơ chế sống sót dưới sự tấn công của hệ miễn dịch vật chủ.

Amoeba ở người	*E. Histolytica*	*E. coli*	*E. gingivalis*	*Endolimax nana*	*Iodoamoeba butschlii*	*Dientamoeba fragilis*
Thể tư dưỡng
Kích thước thể tư dưỡng	25 µm (15-60)	25 µm (15-40)	15 µm (5-35)	9 µm (5-14)	10 µm (6-25)	10 µm (6-25)
Tính di động của tư dưỡng	Hoạt động, tịnh tiến và tiến triển	Chậm chạm, không theo hướng	Di động vừa và cấp tiến	Giống E.coli	Giống E.coli	Nhanh và cấp tiến
Nhân sau khi nhuộm	Có vỏ kín đáo, có chromatin,endosome trung tâm	Vỏ, chromatin, endosome kỳ dị	Giống E. histolytica	Lớn, endosome, không có chromatin ngoại vi	Endosome lớn bao quanh bởi các hạt	Giống E. histolytica, endosome được chia thành 4-6 hạt
Chân giả	Giống ngón chân, bung nổ	Ngắn,cùn, rộng và chậm	Cùn, hình thành nhanh	Giống E. coli	Giống E. coli	Mỏng, giống chiếc lá, hình thành nhanh
Bào nang
Kích thước nang	12 µm (10-20)	17 µm (10-30)	Không	9 µm (5-14)	10 µm (5-18)	Không
Bao gồm glycogen	Phân tán	Không xác định	Không	Vắng mặt	Khối lớn	Không
Nhân	1 - 4	1 - 8	Không	1 - 4	1
Thanh nhiễm sắc	Trong bào nang non, đuôi hình tròn	Trong bào nang non, đuôi hình vỡ vụn		Thi thoảng có hạt	Thường không có

Phân tích biểu hiện gen của thể tư dưỡng hoạt động gây hại được nuôi cấy dưới OS cho thấy sự điều hòa tăng đáng kể các gen mã hóa protein sốc nhiệt (ClpB, HSP70, HSP90 và HSP101); ngược lại, đáp ứng này không có ở thể hoạt động giảm độc lực được nuôi cấy. Phân tích cẩn thận sự khác biệt biểu hiện gen từ dữ liệu hệ phiên mã thu được bằng RNASeq củng cố thêm và làm rõ những quan sát này: ở amíp có độc lực cao, 31 gen HSP được điều hòa tăng một cách riêng biệt (HSP70), 14 gen HSP được điều hòa tăng ở cả hai dòng (HSP101) và chỉ có 1 gen HSP được điều hòa tăng đặc biệt ở các thể hoạt độnggiảm độc lực; hơn nữa, 42 gen HSP được biểu hiện dưới OS ở mức độ tương đương ở cả hai loại thể hoạt động.

Hình 8. Phân biệt hình thái giữa Entamoeba histolytica và Entamoeba coli

Hình 9. Phản ứng stress của thể tư dưỡng hoạt động gây bệnh liên quan đến protein sốc nhiệt thuộc họHSP70.Trong bộ gen của E. histolytica HM1:IMSS, người ta đã xác định được 86 gen mã hóa protein HSP. Trong đó, 78 gen có phản ứng phiên mã ở các thể hoạt động trải qua OS (stress oxy hóa). Phân tích biểu hiện gen của thể hoạt động chịu stress cho thấy họ gen mã hóa HSP70 được điều hòa tăng ưu tiên (tỉ lệ thay đổi >3) ở amíp có độc lực cao, các gen mã hóa HSP101 dường như được điều hòa tăng ưu tiên ở cả amíp gây bệnh và giảm độc lực, trong khi chỉ có một gen mã hóa một yếu tố phiên mã HSP được điều hòa tăng ở amíp giảm độc lực. Ngoài ra, 42 gen mã hóa HSP được biểu hiện ở mức mRNA tương đương ở cả hai loại thể hoạt động trải qua OS. Tiền tố EHI, theo sau bởi số tương ứng với mã số gen trong cơ sở dữ liệu AmoebaDB (AmoebaDB.Org).

Hình9. Stress thể tư dưỡng hoạt động gây bệnh liên quan đến protein sốc nhiệt thuộc họHSP70

HSP là các chaperone phân tử cho phép tế bào tồn tại trong quá trình stress bằng cách duy trì quá trình “gấp” protein đúngcách hạn chế sự biến tính và tập hợp của chúng, một số HSP cũng có vai trò trong việc duy trì sự ổn định bộ gen. Các protein này được phân loại theo khối lượng phân tử của chúng: HSP100 (-101, ClpB), HSP90, HSP70, HSP60, HSP40 và HSP20. Ở loài E. histolytica, HSP70-A (EHI_113410), thuộc về họ HSP70 (13 thành viên), có trong tế bào chất, gen mã hóa được điều hòa tăng lên sau khi có tác dụngcủa O₂, H₂O₂ hoặc NO và trong quá trình hình thành áp xe gan. Do đó, sự ức chế HSP70-A ngăn chặn độc lực, HSP101 được biểu hiện quá mức khi thể hoạt động được xử lý bằng NO và gen duy nhất được biểu hiện quá mức ở ký sinh trùng giảm độc lực là EHI_087630, mã hóa cho một dạng đồng đẳng của yếu tố phiên mã HSP, 5 dạng đồng đẳng khác được biểu hiện ở cùng mức độ trong tất cả các thể hoạt động.

Nhìn chung, dữ liệu này ủng hộ kết luận rằng việc giảm độc lực ở E. histolytica liên quan đến sự ức chế phản ứng stress thông qua HSP. Cho đến nay, các nỗ lực đảo ngược kiểu hình giảm độc lực của ký sinh trùng vẫn chưa thành công và phù hợp với các dữ liệu gần đây, mục tiêu này kêu gọi các thí nghiệm mới để đảo ngược biểu hiện gen HSP ở ký sinh trùng giảm độc lực.

Entamoeba histolytica thể gây bệnh xâm nhập và phá hủy lớp màng nhầy đường ruột: Vai trò các enzyme glycosidase trong quá trình này

Màng nhầy đường ruột của người được cấu tạo từ các mucin được glycosyl hóa cao, chủ yếu là mucin-2 (MUC2). Các O-glycan chiếm khoảng 80% khối lượng mucin MUC2, chúng có acid sialic trên thành phần GalNAc được gắn vào lõi protein. Màng nhầy cũng chứa một số phân tử khác, chẳng hạn như protein liên kết IgGFc và kênh chloride kích hoạt calci 1. Các thành phần này được sản xuất và tiết ra bởi các tế bào hình đài (goblet cells).Một số thành viên của hệ vi sinh vật, vi khuẩn gây bệnh và ký sinh trùng là những loài phân hủy chất nhầy, chúng được biết đến là chứa các glycosyl hydrolase giúp cắt các liên kết glycan cụ thể trong mucin.

Hình 10. Quá trình sinh bệnh của bệnh lỵ a-míp đường ruột.

1. Yếu tố ức chế di cư đại thực bào do E. histolytica tiết ra (EhMIF) thúc đẩy viêm niêm mạc. 2. Viêm do E. histolytica gây ra dẫn đến tăng sản sinh metalloproteinase ngoại bào (MMPs) phá vỡ chất nền ngoại bào (ECM) trong ruột để thúc đẩy di chuyển tế bào.

3. Các tế bào viêm xâm nhập tạo ra các gốc tự do oxy (ROS) có khả năng tiêu diệt ký sinh trùng. Các gốc tự do oxy cũng gây ra tổn thương mô lân cận trong quá trình viêm.

4. E. histolytica xâm nhập vào niêm mạc ruột bằng cách trốn tránh và lợi dụng hệ thống miễn dịch của vật chủ.

5. E. histolytica tiêu diệt tế bào phụ thuộc tiếp xúc.

6. Nồng độ P. copri tăng cao làm tăng nguy cơ viêm đại tràng.

Sự phân hủy lớp màng nhầy đường ruột bởi E. histolytica rất quan trọng đối với quá trình xâm nhập đại tràng và hoạt động này gây ra tình trạng tiết quá mức chất nhầy mới từ các tế bào hình đài. Nhờ mô hình mô thăm dò (explant model) đại tràngtừngười bệnh lỵ amíp, các đường dẫn sinh lý bệnh ban đầu trong quá trình xâm nhập đường ruột củaE. histolytica HM-1: IMSS cho thấy sự phân hủy màng nhầy trong 2 giờ. Sự phân hủy màng nhầy bởi E. histolytica gần đây đã được mô tả bằng hình ảnh thông qua mô hình giàn giáo scaffold (hay còn gọi là giàn giáo sinh học) 3D in vitro của đại tràng người chứa các tế bào hình đài. Phân tích miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đặc hiệu chống-MUC2 và kính hiển vi hai photon định vị được các mảnh mucin trong môi trường niêm mạc hoặc bên trong thể hoạt động. Các đường dẫn tín hiệu amíp được kích hoạt bởi quá trình đưaMUC2 vào vẫn chưa được xác định.

Loài E. histolytica sở hữu nhiềuglycosidase khác nhau như N-acetylgalactosaminidase, N-acetyl-glucosaminidase, β-galactosidase, β-N-acetyl-hexosaminidase và sialidase, một số enzyme này có thể cắt các polysaccharide có trong MUC2, vì chúng có thể được tiết ra hoặc là thành phần các hạt tế bào chất được giải phóng bởi quá trình thải khỏi tế bào (exocytosis) sau khi amíp tương tác với collagen. E. histolytica gặp đại tràng nhanh chóng thay đổi cấu hình hệ phiên mã của nó. Sự gia tăng biểu hiện các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa carbohydrate và glycosylated residue của amípgây bệnh so với amíp giảm độc lực tương quan với các mẫu biểu hiện gen thu được bằng cách so sánh các dòng HM-1: IMSS độc lực và Rhaman không độc lực, trong cùng một mô cấy đại tràng. Các gen mã hóa glycosidase được điều hòa tăng cao gồm: β-galactosidase xúc tác thủy phân β-galactosides thành monosaccharide, cũng như α- và β-amylase hoạt động theo tinh bột, glycogen và các polysaccharide và oligosaccharide liên quan. Vô hiệu hóa các gen mã hóa β-amylase dẫn đến thể hoạt động không thể phân hủy lớp màng nhầy, nên sẽ hạn chế xâm nhập vào đại tràng của người.

Cùng quan điểm với phân tích bệnh sinh và hồ sơ phiên mã của thể tư dưỡng hoạt động gây hại, có thể giả định rằng sự phân hủy saccharide bên trong lớp màng nhầy là nguồn năng lượng quan trọng thúc đẩy khả năng sống của amíp trong quá trình xâm nhập niêm mạc. Các thành phần có nguồn gốc từ chất nhầy có thể bù đắp cho sự thiếu hụt nguồn carbon do giảm quần thể vi khuẩn đặc trưng lớp chất nhầy sâu. Hơn nữa, nhu cầu dinh dưỡng được dự đoán này có thể đi kèm với phản ứng stress của amípgây ra bởi sự di chuyển từ lòng ruột đến môi trường niêm mạc. Giả thiết này tương quan với sự điều hòa tăng của gen mã hóa β-amylase ở E. histolytica trong quá trình xâm nhập đường ruột, sốc nhiệt và OS. Ngược lại, các gen β-amylase bị điều hòa giảm ở thể hoạt động phải chịu OS khi có mặt vi khuẩn. Một thực tế củng cố vai trò của hệ vi sinh vật trong sự sống còn của ký sinh trùng. Các mối liên kết giữa nhu cầu dinh dưỡng và phản ứng stress đối với các gen β-amylase đã được quan sát thấy ở thực vật, nơi chúng phản ứng tích cực với sinh trưởng, phát triển và stress phi sinh vật (abiotic stress). Tầm quan trọng của các hành vi của gen β-amylase này trong bệnh sinh amíp vẫn đang được nghiên cứu. Tuy nhiên, con người thiếu β-amylase và việc ức chế enzyme amíp giúp ngăn chặn bệnh sinh khiến enzyme này trở thành mục tiêu ứng viên có liên quan tiềm năng cho các thuốc chống amíp mới.