|
So sánh tính nhạy kháng với thuốc sốt rét của hai loài Plasmodium malariae và Plasmodium falciparum ở Mali (còn nữa)
Tóm tắt Mục tiêu: Đánh giá độ nhạy kháng của Plasmodiummalariae đối với các loại thuốc chống sốt rét hiện dùng và các loại ứng viên thuốc thử nghiệm hàng đầu; Phương pháp: Chúng tôi đã tiến hành sàng lọc cắt ngang và phát hiện các trường hợp nhiễm sốt rét Plasmodium spp., được lồng ghép trong một nghiên cứu theo dõi dọc và đánh giá hiệu lựcex vivo của một loạt các thuốc chống sốt rét đối với Plasmodium malariae và Plasmodiumfalciparum, các ca nhiễm ở cả hai loài đềulà đơn nhiễm được xác nhận bằng PCR. Các hợp chất tham chiếu được thử nghiệm bao gồm chloroquine, lumefantrine, artemether và piperaquine, trong khi các thuốc chống sốt rét thử nghiệm gồm imidazolopiperazine GNF179, một chất tương tự gần của KAF156 và chất ức chế phosphatidylinositol-4-OH kinase (PI4K) đặc hiệu của Plasmodium KDU691; Kết quả: Chúng tôi phát hiện và báo cáo tình trạng nhiễm sốt rét P. malariaedao động cao (3-15%) với sự giảm đáng kể độ nhạy ex vivo đối với các thuốc chloroquine, lumefantrine và artemether, đây là các loại thuốc hàng đầu hiện nay chống lại nhiễm trùng P. malariae. Không giống như các hợp chất này, đối với thuốcpiperaquine thì sự ức chế mạnh đối với P. malariae và P. falciparum đã được thấy. Ngoài ra, cũng đã đánh giá các hợp chất chống sốt rét tiên tiến hàng đầu. Về mặt này, họ đã xác định được sự ức chế mạnh đối với P.malariae bằng GNF179, một chất tương tự gần của imidazolopiperazine KAF156, là một loại thuốc chống sốt rét mới hiện đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn IIb. Cuối cùng, ngoài GNF179, chúng tôi đã chứng minh rằng chất ức chế đặc hiệu PI4K của Plasmodium KDU691 có khả năng ức chế cao đối với P. malariae và P. falciparum; Kết luận: Dữ liệu cho thấy chloroquine, lumefantrine và artemether có thể không phù hợp để điều trị nhiễm sốt rét P. malariae và cho thấy tiềm năng của piperaquine, cũng như các thuốc chống sốt rét mới imidazolopiperazine và chất ức chế đặc hiệu PI4K trong việc chữa khỏi sốt rétP. malariae. Ước tính có khoảng 228 triệu ca mắc sốt rét trên toàn cầu, trong đó 93% trường hợp xảy ra ở khu vực cận sa mạc Sahara, Châu Phi. Sốt rét đã gây ra khoảng 405.000 ca tử vong trên toàn cầu vào năm 2018. Những nỗ lực toàn cầu nhằm loại trừ sốt rét (LTSR) sẽ trở nên vô ích nếu không thể điều trị hiệu quả các loài Plasmodiumspp., không phải P. falciparumđang bị lãng quên, chẳng hạn như P. malariae. P. malariae phổ biến ở khu vực cậnsa mạc Sahara, Châu Phi và khu vực Đông Nam Á-Thái Bình Dương, nơi tỷ lệ mắc bệnh đã vượt quá 30%. Giống như P.falciparum, nhiễm P. malariae cũng được báo cáo là có liên quan đến gánh nặng thiếu máu cao và có thể dẫn đến nhiễm trùng mãn tính nếu không được điều trị tốt. NhiễmP. malariae cũng có thể gây ra gánh nặng bệnh tật cao liên quan đến các biến chứng nghiêm trọng và có thể tử vong. Do đó, tác động lâm sàng của sốt rét P. malariae đòi hỏi nó phải được ưu tiên trong bối cảnh các chiến lược LTSR, ví dụ như đã được báo cáo ởP.vivax. Một báo cáo gần đây của Victor Yman cho thấy sự suy giảm của nhiễm P. falciparum vào năm 2016 nhưng tăng 2 lầnsố ca nhiễm P. malariae và tăng đến 6 lần số caPlasmodiumovale spp. so với năm 2010. Do đó, việc giải quyết P. malariaelà rất quan trọng để đạt được cột mốc loại trừ bệnh. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), soi kính hiển vi truyền thống là phương pháp chuẩn vàng để chẩn đoán sốt rét trước khi bắt đầu điều trị sốt rét. Tuy nhiên, việc sử dụng kính hiển vi bị ảnh hưởng không nhỏ bởi sai sót của con người, dẫn đến chẩn đoán saiP. malariae, trong khi xét nghiệm chẩn đoán nhanh chỉ có sẵn để phát hiện P. falciparum và P. vivax. Các phân tích PCR có thể được sử dụng để phát hiện các loài Plasmodium khác nhau, tuy nhiên, chúng tốn thời gian và không dễ dàng áp dụng trong môi trường chẩn đoán thường quy ở cấp cơ sở y tế. Ngoài những thách thức trong chẩn đoán, người ta biết rất ít về hiệu lực của các liệu pháp kết hợp dựa trên artemisinin (ACT) hiện tại đối với P. malariae. Mặc dù ACT rất hiệu quả trong điều trị sốt rét P. falciparum ở châu Phi, nhưng ngày càng có nhiều trường hợp thất bại khi dùng artemether-lumefantrine điều trịP. malariae đã được báo cáo. TCYTTG khuyến cáo sử dụng ACTs để điều trị sốt rét P. falciparum và primaquine, tafenoquine và ACT hoặc chloroquine (tùy thuộc vào nhóm 8-aminoquinoline) cho sốt rét P. vivax và P. ovale, nhưng chưa có hướng dẫn điều trị P. malariae. Do không có bằng chứng rộng rãi về kháng thuốc chloroquine lâm sàng ở P. malariae, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Mỹ (US.CDC) đề nghị sử dụng chloroquine đối với nhiễm sốt rétP. malariae; tuy nhiên, thuốc này không còn được sử dụng ở hầu hết các quốc gia thuộc cận sa mạc Sahara, châu Phi. Là ký sinh trùng gây sốt rét phổ biến thứ hai ở khu vực cận hoang mạc Sahara, cần phải xác định các hợp chất có hiệu quả chống lại P. malariae. 
Hình 1. Chu kỳ KSTSR Plasmodium spp. và hậu quả trên cơ thể người ở từng giai đoạn
|Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/B9780323555128001010
Thực tế, các ổ chứa ký sinh trùng P. malariae là một trở ngại để đạt được mục tiêu loại trừ sốt rét. Nghiên cứu này nhằm đánh giá độ nhạy của P. malariae với các loại thuốc kháng sốt rét hiện tại và các thuốc tiềm năng hàng đầu. Thiết kế nghiên cứu, địa điểm và sàng lọc đối tượng nghiên cứu Chúng tôi đã tiến hành sàng lọc cắt ngang và phát hiện các trường hợp sốt rét Plasmodium spp. được lồng ghép trong một nghiên cứu theo dõi dọc, đồng thời đánh giá hiệu lựctrên thử nghiệm ex vivo của một loạt các thuốc chống sốt rét chống lại với P. malariae và P. falciparum như mô tả trong Hình 1. Nghiên cứu này được thực hiện từ tháng 01.2019 đến tháng 12.2019 tại Faladje, một ngôi làng nông thôn thuộc vùng Koulikoro, cách Bamako 80 km. Sốt rét là bệnh lưu hành nặng và hoạt độngchủ yếu theo mùa tại Faladje. Trẻ em trên 1 tuổi và người lớn không mang thai bị sốt rét không biến chứng hoặc không triệu chứng được tuyển chọn vào nghiên cứu nếu có được sự đồng ý bằng văn bản từ bệnh nhân, cha mẹ hoặc người giám hộ của trẻ em. Những bệnh nhân bị sốt rét ác tính, nhiễm HIV hoặc lao mạn tính, hoặc đã dùng thuốc chống sốt rét trong vòng 14 ngày qua đã bị loại trừ ra khỏi nghiên cứu. 
Hình 2. Thiết kế nghiên cứu: Dân cư làng Faladje và bệnh nhân của TTYT địa phương được sàng lọc
bằng kính hiển vi quang học để xác định loài KSTSR, tiếp theo là lấy máu tĩnh mạch từ những người
mang KSTSR để sử dụng cho cả thử nghiệm thuốc ex vivo, bảo quản lạnh và phân tích PCR.
Chú thích:
Faladje village population: Dân số làng Faladje
2025 healthy participants screened with light microscope for all Plasmodium species: 2025 người tham gia khỏe mạnh được sàng lọc bằng kính hiển vi đối với tất cả các loài Plasmodium;
Venous blood collection from Plasmodium positive subjects: Thu thập máu tĩnh mạch từ các đối tượng dương tính với Plasmodium;
Faladje health centre patients: Bệnh nhân từ trung tâm y tế Faladje;
2145 sick participants screened with light microscope for all Plasmodium species:
2145 người tham gia bị bệnh được sàng lọc bằng kính hiển vi đối với tất cả các loài Plasmodium;
PCR assays for Plasmodium species confirmations: Phân tích PCR để xác định loài Plasmodium;
Ex vivo drug assays using freshly collected field isolates: Thử nghiệm thuốc Ex vivo sử dụng các mẫuphân lập thực địa được thu thập mới;
Cryopreservation of freshly collected field isolates: Bảo quản lạnh các mẫu phân lập thực địa được thu thập mới;
Sau khi tiến hành điều tra dân số cộng đồng tại địa điểm nghiên cứu, các đối tượng nghiên cứu (n=4000) được sàng lọc dựa trên các tiêu chí tuyển chọn và loại trừ sau khi có được sự đồng ý tự nguyện tham gia từ cộng đồng và sự đồng ý tự nguyện tham giacủa từng cá nhân. Tất cả bệnh nhân đủ điều kiện mắc sốt rét đều đồng ý tự nguyện tham gia nghiên cứu. Trong khi các mẫu lam máu giọt dày được nhuộm Giemsa và đọc ngay để sàng lọcvà định lượng mật độ KSTSR ban đầu, các lam máu giọt mỏng được sử dụng để xác định loài KSTSR nhằm xác định sự hiện diện mầm bệnh P. malariae. Đối với thử nghiệm thuốc Ex vivo, lấy 3-10 ml máu tĩnh mạch trước khi sử dụng bất kỳ loại thuốc chống sốt rét nào và các mẫu máu khô trên giấy lọc được tạo ra để sử dụng để tách chiết DNA cho các phân tích PCR về sau. Chỉ những mẫu có giai đoạn thể nhẫn>80% mới đủ điều kiện cho thử nghiệm thuốc. QUY TRÌNH PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH DỮ LIỆU Phân tích PCR DNAdi truyền được tách chiết từ các giọt máu khô bằng bộ QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen, Valencia, CA, Mỹ), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phân tích PCR được tiến hành để phân biệt các loài Plasmodiumspp. sử dụng gen rRNA 18S tiểu đơn vị.Sử dụng các kỹ thuật PCR tiên tiến và đáng tin cậy nhất để chẩn đoán các loài KSTSR ở người.Chúng tôi đã thực hiện 02 lần phân tích PCR lồng, đầu tiên để chẩn đoán giốngPlasmodium bằng cặp mồi đặc hiệu giống sau đây: Bộ 1: rPLU1 (TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA) và rPLU5 (CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC) và Bộ 2: rPLU3 (TTTTTATAAGGATAACTACGGAAAAGCTGT) và rPLU4 (TACCCGTCATAGCCATGTTAGG CCAATACC). Phân tích PCR lồng thứ hai dùng để xác định loài Plasmodium spp. cụ thể bằng bộ mồi sau: Bộ 1 như trên và Bộ 3: rFAL1 (TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT) và rFAL2 (ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC) đối với P. falciparum (206 bp); rVIV1 (CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC) và rVIV2 (ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA) đối với P. vivax (121 bp); rMAL1 (ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC) và rMAL2 (AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA) đối với P. malariae (145 bp); rOVA1 (ATCTCTTTTGCTATTTTTTAGTATTGGAGA) và rOVA2 (ATCTAAGAATTTCACCTCTGACATCTG) đối với P. ovale curtisi (787-789 bp)và rOVA1v (ATCTCCTTTACTTTTTGTACTGGAGA) và rOVA2v (GGAAAAGGACACTATAATGTATCCTAATA) đối với P. ovale wallikeri (782 bp). Hỗn hợp phản ứng gồm 25 μL chứa 0,025 U Taq DNA polymerase, 2,5 mM magnesium chloride, 200 μM mỗi loại dNTP và 1 μM mỗi loại mồi. Phản ứng PCR chẩn đoán giống Plasmodium được chạy trong 25 chu kỳ, trong khi phản ứng PCR loài Plasmodiumspp. cụ thể được thực hiện trong 30 chu kỳ. Các đoạn amplicon PCR được tách bằng điện di trên gel agarose 2%. Các dải băng điển hình tương ứng của các loài khác nhau được sử dụng để xác định từng loài. Các mẫu đơn nhiễm được xác nhận để dùng cho xác minh thử nghiệm thuốc ex vivo. Thử nghiệm thuốc ex vivo Các hợp chất được thử nghiệm bao gồm chloroquine, lumefantrine, artemether và piperaquine là loại hợp chất tham chiếu (tất cả từ hãng Sigma), GNF179 - một chất tương tự KAF156 imidazolopiperazines và chất ức chế Plasmodium phosphatidylinositol-4-OH kinase (PI4K), cụ thể KDU69120,21 là các ứng cử viên lâm sàng (cả hai đều được cung cấp bởi hãng Novartis). Đối với thử nghiệm thuốc Ex vivo, lấy máu tĩnh mạch tươi 3-6 giờ chứa giai đoạn vô tính P. malariae và P. falciparum được sử dụng để nuôi cấy KSTSR và đánh giá kháng sốt rét như mô tả trước đây. Điều kiện và môi trường nuôi cấy P. falciparum không bổ sung glucose được sử dụng cho nuôi cấy P. malariae. Trong khi thử nghiệm SYBR Green tiêu chuẩn 48 giờ được sử dụng cho P. falciparum, thời gian thử nghiệm này được kéo dài lên 72 giờ đối với P. malariae do chu kỳ sống dài hơn của KSTSR này. Trong một thử nghiệm thuốc kéo dài, P. falciparum được ủ trong 72 giờ trong khi P. malariae được ủ trong 96 giờ. Thử nghiệm SYBR Green tiêu chuẩn và kéo dài tối ưu sử dụng cácmẫu phân lập tươi được thực hiện trong hai đĩa xét nghiệm riêng biệt tronghai thời điểm lần lượt là giờ 72 và 96 một cách có hệ thống đối với tất cả mẫu phân lập P. malariae. Đối với các mẫu phân lập tươi P. falciparum, thử nghiệm thuốc được thực hiện bằng cách sử dụng các thời điểm 48 và 72 giờ có hệ thống. Mười hợp chất gốc DMSO mM được pha loãng 1/3 theo thứ tự, bắt đầu từ 10 μM, thành tám điểm nồng độ và được thử nghiệm trong các giếng nhân đôi. Ít nhất 10 mẫu phân lập độc lập được thử nghiệm trên mỗi hợp chất. Dữ liệu huỳnh quang được vẽ bằng GraphPad Prism 8. Dữ liệu được đối khớp đường cong với hàm độ dốc biến đổi để ước tính giá trị IC50. Đối với mỗi phân lập, một yếu tố Z’ để đánh giá chất lượng thử nghiệm được tính từ các đối chứng dương tính (8 giếng không thuốc) và đối chứng âm tính (8 giếng đối chứng hồng cầu không KSTSR). Giá trị Z’ trên 0,5 được coi là thử nghiệm tốt, nhưng mỗi đường cong được kiểm tra bằng mắt để đánh giá sự phù hợp. Một số thử nghiệm có Z’ dưới 0,5 có thể được coi là hợp lệ tùy thuộc vào các yếu tố như sai số chuẩn của đường cong phù hợp IC50. Đường cong liều lượng-phản ứng và IC50 được tính bằng phân tích hồi quy phi tuyến tính sử dụng phần mềm GraphPad Prism phiên bản 8, với dữ liệu được chuẩn hóa trước đó với các đối chứng không điều trị. Kiểm định thống kê (tức là kiểm định t) được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism phiên bản 8. Giá trị p<0,05 được coi là có ý nghĩa KHÍA CẠNH Y ĐỨC Đề cương nghiên cứu đã được xem xét và phê duyệt bởi các ủy ban Đạo đức của Khoa Y Nha Dược, Đại học Khoa học và Kỹ thuật và Công nghệ Bamako, Mali với số quyết định tham chiếu 2017/141/CE/FMPOS và 2019/168/CE/FMPOS/FAPH. Chỉ những người tham gia hoặc cha mẹ/người giám hộ của họ đã đồng ý tham gia nghiên cứuthể hiện bằng văn bảnvànhững trẻ em có khả năng hiểu nghiên cứu đã đồng thuận tham gia mới được đăng ký tham gia nghiên cứu này. Tất cả bệnh nhân sốt rét đồng ý tham gia nghiên cứu đều được đăng ký và điều trị bằng liệu pháp thuôc sốt rét chuẩn artemether/lumefantrine được khuyến nghị hoặc quinine trong trường hợp artemether/lumefantrine không loại bỏ được ký sinh trùng.
(còn nữa và tiếp theo phần cuối)
|
TRANG CHỦ
