|
Kỹ thuật sinh học phân tử, hóa sinh, vi sinh và sắc ký lỏng cao áp trong phát hiện, chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh lao.
Vào ngày 24.03.1882, bác sĩ Robert Koch thông báo đã phát hiện được trực khuẩn laoMycobacterium tuberculosis. Trong thời gian này ở Mỹ và châu Âu, cứ 7 người thì có một người chết vì lao, phát hiện của R.Koch là bước ngoặc quan trọng để nhân loại tiến hành kiểm soát và loại trừ căn bệnh chết người này. Lao trước đây, được xem là một trong bộ “tứ chứng nan y”, chịu trách nhiệm bao nhiêu cái chết hàng năm, bệnh lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh không nhỏ, đặc biệt tại các quốc gia châu Phi (thường đồng hành với một số bệnh truyền nhiễm khác như Lao + Sốt rét + HIV/AIDS) hoặc khu vực châu Á, trong đó có Việt Nam. Lao cùng với đại dịch HIV/AIDS lây truyền rộng khặp, nhất là các quốc gia châu Phi, bên cạnh đó sự đồng nhiễm 2 bệnh trên đã khiến cho lao kháng thuốc phát triển mạnh hơn trong vòng 10 năm qua. Hai thập kỷ qua, nhiều thanh tựu tiến bộ y học và phối hợp đa ngành như dược liệu, hóa sinh nhằm chuyển biến và mang lại cuộc sống bệnh nhân lao tốt hơn, loại khỏi vi khuẩn lao triệt để (nghiên cứu các phát đồ chống đa kháng thuốc, vi khuẩn kháng thuốc,…). Thế nhưng, công tác phát hiện và chẩn đoán bệnh vẫn còn gặp nhiều khó khăn nếu như chúng ta chỉ dừng lại ở các kỹ thuật chẩn đoán cổ điển (như xét nghiệm đờm, lấy dịch hút phế quản, chẩn đoán lâm sàng), e rằng sẽ bỏ sót bệnh khá nhiều, bệnh nhân sẽ mất cơ hội điều trị đúng và kịp thời. Đứng trước những khó khăn trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị trên và đặc biệt Tổ chức y tế thế giới đã báo động tình hình lao kháng thuốc tại các quốc gia tăng rất cao, khoảng 500 ca kháng thuốc mỗi năm (WHO, 2008),…Do vậy, một số dự án đầu tư hỗ trợ vào công tác phòng chống bệnh tật như Quỹ toàn cầu (Global fund), Quỹ Ford, Quỹ Bill Gates, ngân sách nghiên cứu của TDR, đặc biệtlà ý thức được vấn đề này nên Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã hoạch định một kế hoạch quy mô để đối phó, sự thành công của kế hoạch tùy thuộc vào sự hợp tác của các quốc giathành viên như khả năng tài chính, riêng năm 2008, WHO đã dự trù một khoảng ngân sách 4.8 tỷ USD để kiểm soát bệnh này và rất trân trọng sự nhiệt tình ở các nhà khoa học trên thế giới đã liên tục nghiên cứu, cải tiến kỹ thuật và phát triển kỹ thuật mới tốt hơn, áp dụng cho chẩn đoán, theo dõi điều trị cho bệnh nhân các bệnh truyền nhiễm nói chung và bệnh lao nói riêng. Đó là các kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật hóa sinh, vi sinh học, sử dụng sắc ký lỏng cao áp ra đời, sử dụng trong y học giúp chẩn đoán bệnh với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao. Hiện nay, các kỹ thuật đó đã và đang ứng dụng trong công tác phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh lao tại bệnh viện và cộng đồng. Bởi vì những khó khăn trong chẩn đoán của test Tuberculin skin test, nên nhiều phương pháp xét nghiệm chẩn đoán được nghiên cứu và triển khai. Những test này được tổng hợp một cách chi tiết: Test Adenosine deaminaseNăm 2007, một tổng hợp rất hệ thống được đánh giá theo chương trình kỹ thuật đánh giá của Quốc gia Mỹ (NHS Health Technology Assessment Programme) kết luận rằng test ADA chẩn đoán tốt cho bệnh lao. Đặc biệt trong lao màng phổi và lao màng não thì test này chẩn đoán tốt hơn bất kỳ test nào khác.Độ nhạy và độ đặc hiệu cũng như độ chính xác có thể lên đến 99%. Thử nghiệm Interferon-γ release assaysThử nghiệm tiết Interferon-γ (IGRAs) dựa trên nguyên lý khả năng tiết kháng nguyên của vi khuẩn lao mycobacterium tuberculosis rất sớm gọi là kháng nguyên đích 6 (ESAT-6) và protein lọc ra từ môi trường nuôi cấy 10 (CFP-10) để kích thích sự sinh interferon-gamma từ vật chủ bệnh. Vì kháng nguyên này bình thường không có mặt ở những đối tượng không bị lao, test này có thể phân biệt nhiễm lao muộn (latent tuberculosis infection_LTBI). Thử nghiệm máu loại QuantiFERON-TB Gold và T-SPOT.TB dùng kháng nguyên này để phát hiện người nhiễm lao. Các lymphocytes từ máu bệnh nhân được nuôi cấy với kháng nguyên. Nếu bệnh nhân có phơi nhiễm lao trước đó, T lymphocytes sinh ra đáp ứng interferon γ. Cả 2 laọi test ELISA đều có độ nhạy rất lớn để phát hiện interferon γ. Điểm khác biệt giữa testQuantiFERON-TB Gold là định lượng interferon γ trong máu toàn phần khi phơi nhiễm với kháng nguyên, ngược lại test T-SPOT.TB là một loại thử nghiệm ELISPOT, đếm số lượng lymphocyte T hoạt hóa có tiết interferon γ. Thử nghiệm xét nghiệm máu toàn phần (Full blood count)Mặc dù đếm máu toàn phần chưa bao giờ thực hiện nhằm mục đích chẩn đoán, thiếu máu nhược sắc và tăng lympho bào thường thấy. bạch càu neutrophile hiếm gặp hơn. [thiếu máu thiếu sắc có thể xuất hiện do điều trị bằng isoniazid], urea và điện giải thường nằm trong giới hạn bình thường, mặc dù hạ canxi máu và natri máu có thể có trong trường hợp viêm màng não do lao do hội chứng SIADHS. Trong trường hợp bệnh tiến triển, có thể giảm albumin máu, tăng protein máu và globuline máu, tốc độ máu lắng tăng. Kỹ thuật sinh học phân tử 1. Kỹ thuật khuyếch đại chuỗi DNA (PCR_Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật phản ứng chuỗi PCR từ lâu được áp dụng trong chẩn đoán, phát hiện các bệnh truyền nhiễm, trong đó có bệnh lao. Kỹ thuật PCR xác định nhanh trực khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy và trong các bệnh phẩm rất chính xác. Một số kỹ thuật khác của PCR có thể xác định typ, gen của các chủng trực khuẩn lao, hoặc có khả năng chẩn đoán phân biệt và xác định chủng laokháng thuốc, tái nhiễm (nhiễm mới-Reinfection) hay tái phát (Relapse) trên một bệnh nhân sau điều trị đủ, đúng liều, giúp các nhà làm chính sách đưa ra các phác đồ phù hợp trong điều trị bệnh lao. Nguyên lý của kỹ thuật là từ một đoạn DNA chọn lọc của trực khuẩn lao, người ta nhân nó lên gấp hàng triệu lần trong thời gian ngắn với những chu kỳ cài đặt sẵn. Qua thời gian, sự sao chép ADN được tạo ra trong môi trường in vitro. Để tạo được quá trình này, trước tiên chuỗi DNA kép được tách ra thành chuỗi DNA đơn nhờ vào một men đặc biệt. Làm nguội các nhánh đơn này rồi nhờ xúc tác của enzym DNA polymerase và các tiền chất deoxynucleotid tương ứng để nhánh DNA bổ sung được tổng hợp. Trong môi trường In vitro, quá trình này không thể tự phát xảy ra mà phải có các đoạn ADN mồi (primer) sẽ tổng hợp tại những vị trí bổ sung trên hai chuỗi đơn theo nguyên tắc bổ sung từ đầu 3’ hoặc 5’, các mồi khởi động đặc hiệu cho chuỗi bazơ thường được tổng hợp nhân tạo. Từ vị trí gắn của mồi khởi động, nhánh bổ sung sẽ được tổng hợp và nhân lên nhiều lần số DNA. Mồi khởi động mang tính đặc thù riêng cho mỗi DNA có trình tự nhất định, với một loại mồi khởi động thì chỉ DNA đặc hiệu với nó được sao chép, nên DNA của trực khuẩn lao có thể sao chép một cách đặc hiệu từ bệnh phẩm chứa đựng DNA của nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Sau khi các chuỗi bổ sung đã được tổng hợp xong, hai chuỗi kép được tạo thành qua quá trình này sẽ lại được phân tách ra và quá trình tổng hợp được lặp lại như trên để sản sinh ra 4 chuỗi và cứ như thế tiếp diễn. Bằng cách sử dụng một loại polymerase DNA bền với nhiệt Hemophilus aquaticus, có thể trộn lẫn bệnh phẩm với các tiền chất deoxynucleotid mồi thử cho hai chuỗi và polymerase, sau đó hỗn hợp này được đưa vào chu trình xử lý bằng nhiệt độ thích hợp với sự phân tách chuỗi, tiếp cận mồi và tổng hợp các chuỗi bổ sung. Trong vòng 60 phút, sự khuyếch đại có thể lên tới 1 triệu lần. DNA khuyếch đại dễ dàng được phát hiện bằng chất dò đặc hiệu. Phản ứng chuỗi polymerase có thể được thực hiện tại chỗ, trên tiêu bản chứa bệnh phẩm. Phản ứng này đã được đưa vào sử dụng trong chẩn đoán, phát hiện bệnh và giám sát điều trị bệnh lao, ngay cả lao kháng thuốc. Tuy nhiên, điều kiện tiến hành kỹ thuật phải hết sức đảm vô khuẩn tránh tạp nhiễm, tránh những sai sót trong suốt quá trình làm. Để đạt được độ nhạy (Se) và độ đặc hiệu (Sp) mong muốn thì nên loại bỏ được các chất ức chế có trong bệnh phẩm, chất ức chế đó có thể là DNA (không phải chuỗi đích) của các tế bào miễn dịch, tế bào viêm có trong bệnh phẩm. Phải làm sao có được DNA tinh khiết đó là điều rất khó và cần có trong quy trình làm kỹ thuật PCR thường qui. Một trong những nghiên cứu đầu tiên sử dụng PCR trong chẩn đoán lao trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm đờm là nghiên cứu của nhóm nghiên cứu Eisenach K.D., Sifford M.D., Cave M.D. và cộng sự (1991) trên 162 mẫu đờm. Các tác giả đã phân biệt được trực khuẩn lao với các Mycobacterium không lao khác (Mycobacterium atypi) bằng cách sử dụng đoạn trình tự IS 6110. Tiếp đó, Brisson-Noel và cộng sự (1991) tiến hành trên 514 mẫu với loại bệnh phẩm khác nhau (đờm, dịch hút từ dạ dày, dịch màng phổi, dịch phế quản), Kolk A.H.J. (1992) tiến hành trên 75 bệnh phẩm, Forbes B. và Hicks K.E.S. (1993) tiến hành trên 734 mẫu bệnh phẩm, De Wit D. và cộng sự (1993), Clarridge J.E. và cộng sự (1993) thực hiện trên số mẫu bệnh phẩm lớn, lên đến 5000 mẫu, các nghiên cứu của Yuen K.Y., Chan và cộng sự (1993), Schluger N. và cộng sự (1994)... đều cho những kết quả rất khả quan với độ nhạy rất cao từ 76.90-94% và độ đặc hiệu từ 92-99.34%. Trong các thể lao ngoài phổi, đặc biệt lao màng não thì kỹ thuật PCR có vai trò quan trọng phát hiện, chẩn đoán nhanh, chính xác các thể lao này (Berenguer J. và cs.,1992) hoặc chẩn đoán lao màng phổi (De Lassence A và cs., 1992), lao màng ngoài tim (Godfrey-Fausett P và cs., 1991). PCR còn được sử dụng trong chẩn đoán trực khuẩn lao kháng thuốc, sử dụng PCR xác định được chủng trực khuẩn lao kháng thuốc Isoniazide (Zhang Y. và cs (1992) do thiếu gen catalase (gen Kat G); phát hiện điểm đột biến kháng thuốc trên đoạn DNA (Sekiya T và cs., 1993); hoặc phát hiện đột biến kháng thuốc của trực khuẩn lao với thuốc lao cổ điển Rifampicine (Imboden P. và cs.,1993); phân lập gen kháng thuốc Rifampicine (Donnabella V. và cs.,1993). 2. Kỹ thuật về tính đa hình sử dụng men phân cắt giới hạn Kỹ thuật đa hình sử dụng men phân cắt giới hạn (RFLP-Restriction fragment length polymorphism) dựa trên sự tách biệt từng đoạn DNA được men endonuclease giới hạn nhờ chất Sodium dodencyn sulphat SDS-PAGE. Sự di chuyển của DNA từ thạch đến màng thấm và việc sử dụng một hay nhiều DNA thǎm dò chỉ làm bộc lộ một vài đoạn có chứa những chuỗi base với trình tự đặc hiệu. Kỹ thuật tuy không nhạy bằng cách ức chế endonuclease nhưng kết quả rõ ràng hơn, kỹ thuật còn để so sánh sự khác biệt của các trực khuẩn lao, xác định được một vài Mycobacterium phân lập từ bệnh viêm ruột mạn tính Crohn do loài vi khuẩn M. paratuberculosis và xác định được phần lớn các M. avium nội bào trên bệnh nhân HIV/AIDS có nhiễm trùng cơ hội. 3. Kỹ thuật giải trình tự chuỗi acid nucleic Kỹ thuật giải trình tự chuỗi acid nucleic (NASBA_Nucleic acid sequence-leased amplification) dựa trên nguyên lý thực hiện trên chuỗi 16Sr RNA, kỹ thuật này được Van der Vliet và cộng sự khởi xướng và cho rằng đánh giá được khả nǎng sống sót của Mycobacterium, ứng dụng rất tốt trong việc giám sát bệnh nhân trong quá trình điều trị bệnh lao. 4. Kỹ thuật khuyếch đại vi khuẩn lao trực tiếp Kỹ thuật khuyếch đại vi khuẩn lao trực tiếp (AMTDT_Amplified M. tuberculosis direct test) cũng dựa trên sự khuyếch đại ARN. Qua nhiều nghiên cứu, kết quả cho thấy phương pháp này có độ nhạy từ 71 - 79%, độ đặc hiệu (Sp) từ 96 - 99%. Hiện tại có hai loại test rất phổ dụng trên thị trường để chẩn đoán bệnh lao là mycobacterium tuberculosis direct test (MTD, Gen-Probe) và Amplicor (Roche Diagnostics). Trong năm 2007, theo kết quả đánh giá của hội đồng đánh giá tiêu chuẩn kỹ thuật của Mỹ (NHS Health Technology Assessment Programme) kết luận vè giá trị của test qua nhiều nghiên cứu, nghiên cứu cũng đáng tin cậy khi đánh giá trước sau cho thấy độ chính xác của MDT test như sau: Tổng thể Trên các bệnh nhân có test đờm dương tính, thì giá trị của test còn cao hơn: Nhưng trên các bệnh nhân có test đờm âm tín thì thấp hơn: 5. Kỹ thuật phản ứng chuỗi LCR cho vi khuẩn M. tuberculosis Kỹ thuật được tiến hành dựa trên phản ứng chuỗi ligase (ligase chain reation) khuyếch đại ADN có thể xác định nhanh M. tuberculosis trong bệnh phẩm. Kỹ thuật này có độ nhạy cao trong phát hiện, chẩn đoán các thể lao ngoài phổi. 6. Một số kỹ thuật khác Kỹ thuật COBAS AMPLICOR PCR,kỹ thuật TMA(transcription -mediated amplification),kỹ thuật SDA(strand displacement amplification), kỹ thuật QB(QB replicase amplification), kỹ thuật CPR(cycling probe reaction) gần đây cũng được nghiên cứu và đang hoàn thiện quy trình kỹ thuật trong chẩn đoán và theo dõi điều trị các bệnh truyền nhiễm khác nhau. Các kỹ thuật hóa sinh và vi sinh học Từ những nǎm cuối của thập kỷ 80 đến đầu thập kỷ 90 đến nay nhiều kỹ thuật hóa sinh và vi sinh học đã được nghiên cứu, một số kỹ thuật bước đầu được đưa vào áp dụng trong phạm vi hẹp chủ yếu ở các nước đang phát triển Bắc Mỹ và châu Âu để có thể phát hiện chẩn đoán sớm bệnh lao. Các kỹ thuật này tương đối đơn giản, không quá đắt tiền, có thể phổ biến với độ nhạy, độ đặc hiệu khá cao. 1. Phân tích các thành phần lipid đặc hiệu của vách tế bào mycobacterium bằng sắc ký để định danh mycobacterium Một số kỹ thuật sắc ký được ứng dụng trong nghiên cứu chẩn đoán, phát hiện chủng lao cũng như định danh như sắc ký khí (GC_gas chromatography), sắc ký khí lỏng (GLC_gas-liquid chromatography), sắc ký lớp mỏng (TLC_thin layer chromatography), sắc ký lỏng cao áp (HPLC_: high performance liquid chromatography),… Tisdale và cộng sự đã dùng kỹ thuật sắc ký khí lỏng xử lý vi khuẩn bằng methalonic NaOH và có thể định danh hầu hết các loại Mycobacterium dựa trên các vạch sắc ký; Guerrant và cộng sự dùng acid metanolysis chiết tách các methyl ester của mycolic acid từ vách tế bào Mycobacterium giảm được nhiều thời gian phân tích và tǎng được độ nhạy so với kỹ thuật của Tisdale (thời gian phân tích chỉ < 2 giờ); Hãng Microbial ID, Inc. Newark DE có hệ thống định danh Mycobacterium cũng dựa trên máy sắc ký khí HP 5890A và máy tính HP 310 có phần mềm chứa dữ liệu về thành phần lipid vách tế bào của 26 loại Mycobacterium gây bệnh thường gặp dựa trên danh mục chủng vi khuẩn chuẩn ATCC; Glickman và cộng sự đã thiết kế phần mềm chứa mẫu mycolic acid của 45 loại mycobac-terium và dùng kỹ thuật sắc kỹ lỏng cao áp để định danh 1333 chủng Mycobacterium, đạt độ nhạy 97%, độ đặc hiệu 99,8% (Koneman E.W. và cs 1997). 2. Các kỹ thuật xác định acid béo trong vách tế bào trực khuẩn lao 2.1. Kỹ thuật xác định tuberculostearic acid (TBSA) TBSA là acid béo có trong thành phần cấu trúc vách tế bào mycobacterium. Kỹ thuật sắc ký khí khối phổ (GC-MS_Gas chromatography mass spectrometry) được sử dụng. Khi cấu trúc của vách tế bào mycobacterium được máy sắc ký tách thành các đơn chất, các chất này được ion hóa và chuyển động trong điện trường của máy đo khối lượng phân tử, từ các ion đo lường được, người ta suy ra khối lượng của chúng. Qua đó có thể xác định được TBSA có trong bệnh phẩm. Bệnh phẩm có thể là mẫu đờm, dịch hút dạ dày, dịch não tủy, dịch màng phổi, dịch màng bụng,... Koneman E.W. và cs (1997); French G.L., Teoh R. và cs (1987); Brooks J.B., Daneshvar M.I. và cs (1990) đã dùng kỹ thuật này để xác định mycobacterium trong lao màng não. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật trong phát hiện, chẩn đoán lao màng não lên tới 95%, thời gian trả lời kết quả trong vòng 3 giờ. Chú ý rằng TBSA không chỉ có trong thành phần cấu trúc của vách tế bào mycobacterium mà còn có trong thành phần cấu trúc vách tế bào của Actinomycetes như Nocardia asteroides, do đó điều kiện đảm bảo cho sự chính xác là bệnh phẩm phải không có các loại nói trên (bình thường trong cơ thể không có các loại này). 2.2. Kỹ thuật xác định mycolic acid bằng sắc ký lỏng áp lực cao sử dụng huỳnh quang (HPLC-FL: high-performance liquid chromato-graphy utilizing fluorescence) Kỹ thuật xác định mycolic acid bằng sắc ký lỏng áp lực cao sử dụng huỳnh quang (HPLC-FL_high-performance liquid chromatography utilizing fluorescence) được dùng để định danh nhanh vi khuẩn M. tubeculosis và M. avium trực tiếp từ mẫu bệnh phảm đờm của bệnh nhân. Lao đa kháng thuốc (MDR_TB_Multidrug resistance tuberculosis) và lao cực kháng thuốc (EDR-TB_Extensively drug resistance tuberculosis) cần một sự can thiệp mạnh mẽ là mối đe dọa lớn cho nhiều người từ các quốc gia, một trong những lý do dẫn đến hậu quả này là do khâu chẩn đoán và điều trị không đúng, không kịp thời, không đủ liều. Trên đây là một số kỹ thuật phát hiện, chẩn đoán hiện đại đã và đang áp dụng rất nhiều tại các quốc gia phát triển (nơi các bệnh viện hiếm khi đối mặt với bệnh lao thì kiến thức cận lâm sàng hướng lao mai một theo thời gian) và quốc gia đang phát triển. Song kỹ thuật này sẽ hỗ trợ bổ sung kỹ thuật hay phương pháp kia vì bản thân mỗi xét nghiệm cơ ưu nhược điểm nhất định.Việc lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm cũng là một “nghệ thuật” ở người thầy thuốc lâm sàng. Tài liệu tham khảo - Steingart K, Henry M, Ng V, et al. (2006). "Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis: a systematic review". Lancet Infect Dis 6 (9): 570–81.
- Brown M, Varia H, Bassett P, Davidson RN, Wall R, Pasvol G (2007). "Prospective study of sputum induction, gastric washing, and bronchoalveolar lavage for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in patients who are unable to expectorate". Clin Infect Dis 44 (11): 1415–20.
- Moore D, Evans C, Gilman R, Caviedes L, Coronel J, Vivar A, Sanchez E, Piñedo Y, Saravia J, Salazar C, Oberhelman R, Hollm-Delgado M, LaChira D, Escombe A, Friedland J (2006).
- "Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB". N Engl J Med 355 (15): 1539–50.
- CDC.Guidelines for Using the QuantiFERON-TB Gold Test for Detecting Mycobacterium tuberculosis Infection, United States
- Dinnes J, Deeks J, Kunst H, Gibson A, Cummins E, Waugh N, Drobniewski F, Lalvani A (2007). "A systematic review of rapid diagnostic tests for the detection of tuberculosis infection". Health Technol Assess 11 (3): 1–314.
- Guerra RL, Hooper NM, Baker JF, et al (2007). "Use of the Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test in a Public Health Laboratory: Test Performance and Impact on Clinical Care". Chest 132 (3): 946–51.
- Ferrara G et al. (2006). "Use in routine clinical practice of two commercial blood tests for diagnosis of infection with Mycobacterium tuberculosis: a prospective study" (abstract). Lancet 367 (9519): 1328–1334.
- Lalvani A (2003). "Spotting latent infection: the path to better tuberculosis control". Thorax 58 (11): 916–8.
- Menzies D, Pai M, Comstock G (2007). "Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research". Ann. Intern. Med. 146 (5): 340–54.
|
TRANG CHỦ
