 |
| Protein Structure |
Cấu tạo và sự nhân lên của plasmid (Phần 3)
(Tiếp theo phần 2)
Plasmids (thường) là các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể. Chúng thường hiện diện trong vi khuẩn, đôi khi cũng có ở sinh vật có nhân thật (eukaryote) (ví dụ như vòng 2 micrometre ở Saccharomyces cerevisiae). Chúng có kích thước khoảng từ 1 đến hơn 400 kilobase pairs (kbp). Chúng có thể hiện diện chỉ một bản sao, đối với plasmid lớn, cho tới vài trăm bản sao trong cùng một tế bào.
3. Sự nhân lên của plasmid 3.1. Mở đầu Khi tế bào phân chia, plasmid có khả năng tự nhân lên 1-2 bản sao (đối với plasmid lớn) hoặc vài chục đến vài trăm bản sao (đối với plasmid bé). Sự nhân lên của plasmid cũng xảy ra rất nhanh, trong vòng vài chục phút, đúng như thời gian trực phân của một tế bào vi khuẩn, ví dụ như vi khuẩn E. coli chẳng hạn, cứ khoảng 20 phút là có một chu kì phân chia. Thời gian trực phân 20 phút cho một chu kì là đối với vi khuẩn E. coli nuôi trong môi trường nhân tạo có đầy đủ chất dinh dưỡng. Trong trường hợp đối với E. coli tồn tại trong hệ tiêu hóa người và động vật, thì thời gian trung bình cho một thế hệ phân chia là 12 giờ. Trong mọi tình huống và mọi điều kiện, plasmid luôn luôn đảm bảo theo sát thời gian phân chia của một thế hệ vi khuẩn chủ, và chủ động tạo ra đúng số bản sao plasmid cần thiết để truyền cho thế hệ vi khuẩn sau. Một số hoạt chất hoặc dược chất có khả năng ngăn cản ADN của plasmid nhân lên, và do vậy, sau một vài thế hệ phân chia của vi khuẩn chủ, plasmid được làm sạch khỏi vi khuẩn. Các chất này được gọi là các tác nhân diệt trừ (curing agents). Ví dụ, chất acridin orange can thiệp vào sự nhân lên của loại plasmid F, là loại tạo cầu nối giữa hai tế bào vi khuẩn và một số plasmid khác, làm cho chúng không thực hiện được quá trình nhân lên của mình một cách có hiệu quả. Một dược chất khác, mitomycin-C, có tác dụng ngăn cản sự nhân lên của ADN của tế bào nói chung, và do vậy đây cũng là một tác nhân diệt trừ hữu hiệu đối với ADN của plasmid, đặc biệt là plasmid của vi khuẩn Pseudomonas. Sự nhân lên của plasmid có thể chia làm 3 giai đoạn chính: giai đoạn khởi đầu, giai đoạn tổng hợp ADN của plasmid và giai đoạn kết thúc. Giai đoạn khởi đầu là giai đoạn khá cơ bản của toàn bộ quá trình. 3.2. Sự nhân lên của plasmid không tiếp hợp (plasmid ColE1) Nói chung các loại plasmid không tiếp hợp là các loại plasmid độc lập, và là các loại plasmid nhỏ, cơ động, thường nhân lên với số lượng nhiều bản sao và thực hiện đầy đủ cả 3 giai đoạn nhân lên. Một ví dụ điển hình là plasmid ColE1 của E. coli, có phân tử lượng 4.3x 106, có khả năng sản xuất 8 loại protein, mỗi loại có phân tử lượng khoảng 30.000 danton (Da). Plasmid ColE1 có gen sản xuất colicin E1, là 1 loại kháng sinh. Các loại protein khác chưa rõ chức năng, nhưng chắc chắn không có một loại protein nào mà ColE1 sản xuất là enzym xúc tác cho sự nhân lên của chính plasmid. Plasmid ColE1 là loại hoàn toàn phụ thuộc vào các enzym của vi khuẩn chủ để thực hiên sự nhân lên của mình a.Giai đoạn khởi đầu của sự nhân lên của plasmid ColE1 Sự nhân lên (sao thêm 1 bản ADN khác) của plasmid bắt đầu từ 1 điểm mầm nằm trong vùng mầm và tiếp tục chạy vòng cho đến khi trở lại điểm đó. Enzym xúc tác cho quá trình này có tên gọi là gyraza. Ngày nay người ta được biết có sự tham gia của cả phức hợp enzym bao gồm helicaza (mở vòng xoắn); primaza (xúc tác tạo ADN làm mồi) và ADN-polymeraza (tổng hợp ADN). Vùng mầm là vùng có chức năng đặc hiệu của plasmid với vi khuẩn chủ, vì ở đó có sự tương tác đặc hiệu với hệ gen của vi khuẩn chủ. Đó cũng là nơi hệ enzym xúc tác của vi khuẩn chủ bám vào, nhằm tạo điều kiện khởi đầu để thực hiện quá trình nhân lên của plasmid. Những plasmid không thích hợp với vi khuẩn chủ, nếu lạc vào, đều không thể nhân lên được và bị đào thải, do không có sự tương tác đặc hiệu giữa vùng mầm mà chúng có, với hệ gen của vi khuẩn, quyết định cho quá trình nhân lên.  | | Hình 2.2: Các bước tổng hợp ADN của plasmid ColE1 trong quá trình nhân lên. |
Tại điểm mầm oriV, sợi nhẹ (L) và sợi nặng (H) được bung ra (bước 1), một đoạn ARN được nhanh chóng tổng hợp và làm mồi để tổng hợp sợi nặng (hay sợi dương), rồi sau đó là tổng hợp sợi nhẹ (hay sợi âm) (các bước 2, 3). Đối với sợi âm, ADN của plasmid được tổng hợp từng phân đoạn (còn gọi là phân đoạn Okazaki) và cuối cùng được gắn lại với nhau, sau khi loại bỏ ARN làm mồi (bước 4) (Xem chi tiết trong bài). Cơ chế cụ thể có thể tóm tắt như sau: tại 1 điểm gần điểm mầm, nằm trong vùng mầm, bắt đầu thực hiện quá trình sao chép (transcription) để tạo ra 1 đoạn ARN ngắn. Đoạn ARN này hành động như một đoạn mồi (primer), và trượt trên sợi ADN của plasmid dùng làm khuôn để tổng hợp nên ADN mới. Đoạn ARN này hoạt hóa điểm mầm, có lẽ làm gãy điểm mầm ở 1 trong 3 nucleotid (TTG) làm cho sợi ADN bung ra (Hình 2.2). Đối với plasmid ColE1, ARN làm mồi và enzym ARN-polymeraza của vi khuẩn chủ có vai trò quan trọng trong quá trình khởi phát và mở sợi ADN của plasmid tại điểm mầm. ARN được sao chép bắt đầu tại một điểm cách điểm mầm 555 nucleotit về phía trước, chạy xuyên qua điểm mầm, và kết thúc ở bất kỳ một điểm nào sau đó. Sau đó, đoạn ARN mới tổng hợp khá dài này, bị cắt vụn ra bởi men ARN-aza H (là một enzym do vi khuẩn chủ cung cấp), tạo nên rất nhiều ARN ngắn, để hoạt động như những đoạn làm mồi lại tiếp tục cho quá trình bắt đầu tổng hợp ADN của plasmid. Với ARN-mồi làm mồi cho sự khởi phát, và cùng với sự xúc tác của ADN-polymeraza của vi khuẩn chủ, sợi ADN mới được tạo ra, chạy vòng cho đến lúc quay lại vị trí cũ, và lúc đó sự tổng hợp ADN của plasmid được kết thúc. Vùng mầm của plasmid ColE1 gồm 580 nucleotit, và có vai trò cực kỳ cần thiết cho sự nhân lên. Trong vùng mầm, có khoảng 100 nucleotit bao quanh điểm mầm là không thể thay thế được, trong đó có khoảng 12-13 nucleotit nằm sau điểm mầm có vai trò thiết yếu. Mọi sự đột biến điểm (tức là thay thế hay biến đổi một nucleotit nào đó) trong dãy này, đều dẫn đến sự diệt vong của plasmid. b.Giai đoạn tổng hợp ADN của plasmid Sau khi sợi ADN của plasmid mẹ bung ra làm khuôn, và ARN-mồi bám vào, cùng với 1 số enzym xúc tác và protein trợ giúp, quá trình tổng hợp ADN của plasmid bắt đầu được tiến hành. Thực chất, ADN tổng hợp không phải là một sợi liên hoàn, mà là những phân đoạn ADN dài ngắn khác nhau, thường có độ dài khoảng 500 nucleotit mỗi đoạn, hoặc 1000 nucleotit mỗi đoạn (còn gọi là phân đoạn Okazaki, đặt tên từ người phát hiện ra nó). Trong quá trình tổng hợp của ADN của plasmid, có sự tham gia của ADN-polymeraza của vi khuẩn chủ, mà chủ yếu là ADN- polymeraza III. Lúc này, các ARN-mồi gắn vào đầu các phân đoạn ADN mới (các phân đoạn Okazaki) sẽ được loại bỏ, rồi các phân đoạn ADN mới này tiếp tục được gắn với nhau bằng men ADN-ligaza, để tạo nên sợi ADN liên hoàn và khép kín (Hình 2.2). c.Giai đoạn kết thúc Trong giai đoạn này, hai sợi ADN mới tạo thành được hợp lại với nhau theo cơ chế bổ sung qua liên kết hydro (liên kết thuận nghịch giữa các nucleotit bổ sung) để tạo nên vòng ADN của plasmid mới. Hai sợi ADN của plasmid mẹ, trước đây làm nhiệm vụ là các sợi khuôn, tách khỏi vòng ADN mới, trước khi vòng ADN mới được khép kín lại. Quá trình tách khỏi này có vai trò của enzym ADN-gyraza. Trong quá trình gắn các phân đoạn ADN mới lại với nhau, có sự tham gia của enzym ADN-polymeraza I và ADN-ligaza. Ngay sau khi vừa khép kín để tạo thành plasmid mới, men ADN-gyraza ngay lập tức lại bám vào và tiếp tục xúc tác cho sự mở bung ra làm khuôn, để tiếp tục tạo nên các vòng ADN của plasmid mới, đủ để phân ra làm 2 nhóm, chia đều cho 2 tế bào vi khuẩn chủ. Tuy các giai đoạn nhân lên của plasmid có vẻ phức tạp, nhưng thực tế, sự tổng hợp plasmid diễn ra khá nhịp nhàng và rất nhanh chóng, theo kịp tiến độ phân chia của tế bào vi khuẩn chủ. 3.3. Sự nhân lên của plasmid tiếp hợp (plasmid F) Plasmid tiếp hợp (conjugative plasmid hay còn gọi là plasmid F, lấy tên từ fertility) khác với plasmid không tiếp hợp (ví dụ plasmid ColE1) ở số lượng tồn tại trong một tế bào. Mỗi một tế bào vi khuẩn chủ chỉ có 1-2 plasmid F. Chúng còn khác ở chỗ, là bản thân plasmid F có khả năng tạo ra ít nhất là một loại sản phẩm protein cần thiết để tham gia vào quá trình nhân lên. Plasmid không tiếp hợp, mà đại diện là plasmid ColE1 hoàn toàn phụ thuộc vào enzym và sự tham gia điều hoà tổng hợp của tế bào chủ. Không phải tất cả plasmid tiếp hợp đều có phương thức nhân lên như nhau. Một số thực hiện sự nhân ADN của mình theo vòng xoay một chiều, số khác lại quay theo hai chiều ngược nhau. Một vài plasmid tiếp hợp khác với plasmid không tiếp hợp (plasmid ColE1, như đã trình bày) ở chỗ chúng là một vòng ADN rất lớn, và chứa đến hai vùng mầm ori (origin), cần thiết khởi phát cho sự nhân lên. Trong những trường hợp đặc biệt, khi một vùng này bị vô hoạt, chúng có khả năng sử dụng vùng mầm kia để khởi điểm đảm bảo cho sự nhân lên không bị đình trệ. Các loại plasmid tiếp hợp khác nhau, có thể trong đó, bao gồm các loại plasmid kháng thuốc nào đó, chúng có thể chọn nhiều cách để nhân lên, hoặc theo kiểu của plasmid ColE1, hoặc theo kiểu của plasmid F, hoặc phần lớn theo cả hai. Chúng tôi xin giới thiệu sự nhân lên của plasmid F, một loại plasmid tiếp hợp điển hình được nghiên cứu khá rộng rãi (Hình 2.3). Khi cầu tiếp hợp được nối lại giữa tế bào vi khuẩn “cho” và tế bào vi khuẩn “nhận”, có một loại tín hiệu đặc biệt được truyền cho tế bào “nhận”. Bản chất của tín hiệu này (thành phần, cấu trúc, gen mã hoá...) thực sự còn chưa sáng tỏ. Theo Jacob (1963), thì màng tế bào đóng vai trò quan trọng, trong đó có một loại protein màng nào đó, làm nhiệm vụ “báo tin” đến tế bào vi khuẩn “nhận” là sẽ có sự chuyển giao ADN của plasmid, thậm chí cả ADN của tế bào (một phần nhỏ hệ gen của tế bào) sẽ xảy ra. Ngay lập tức lúc đó, theo cơ chế mở vòng nói chung của ADN như đã trình bày, tức là có sự tham gia của men ADN-gyraza phụ thuộc ATP (lấy năng lượng từ ATP), ADN của plasmid được mở vòng tại điểm mầm oriV, hay còn gọi là điểm mầm sinh trưởng (vegetative origin). Sợi dương ADN của plasmid được tách ra và luồn qua ống rỗng protein đang làm cầu tiếp hợp giữa 2 tế bào (còn gọi là lông giới tính hay sex pili), chuổi ADN được chuyển giao ngay lập tức với đầu 5¢ của ADN đi trước luồn sang tế bào vi khuẩn “nhận”. Vòng ADN trong tế bào “cho”, quay theo hướng quay tròn (rolling circle), và sợi dương tiếp tục được chuyển giao cho đến khi kết thúc (Hình 2.3).  | | Hình 2.3: Chuyển giao ADN của plasmid trong quá trình tiếp hợp. |
Trong tế bào “cho”, ADN của plasmid được mở bung ở điểm mầm oriV, sau đó 1 sợi ADN (sợi dương) được chuyển giao qua cầu tiếp hợp sang tế bào “nhận” theo chiều quay như bánh xe (mũi tên đậm). Cùng lúc, ADN được tổng hợp theo cơ chế bổ sung ở cả 2 tế bào theo chiều trượt 5´-->3´ (xem chi tiết trong bài). Cùng đúng với thời điểm chuyển giao sợi dương, ngay trong vi khuẩn “cho”, sợi ADN còn lại (sợi âm) chịu trách nhiệm làm khuôn để tổng hợp ngay lập tức sợi bổ sung cho nó (tổng hợp sợi dương) để tạo nên vòng plasmid mới. Cùng lúc đó, trong tế bào “nhận”, sợi ADN vừa được chuyển sang (sợi dương), cũng ngay lập tức làm khuôn để tổng hợp sợi bổ sung (tổng hợp sợi âm) để hình thành vòng ADN của plasmid mới cho tế bào “nhận”. Như vậy, thực chất quá trình nhân lên của một plasmid tiếp hợp, là sự tiếp nhận sợi dương và tổng hợp sợi âm ở tế bào vi khuẩn“nhận”, và sự giữ lại sợi âm và tổng hợp bổ sung sợi dương ở tế bào vi khuẩn“cho”, nhằm đảm bảo có cả 2 plasmid ở cả 2 tế bào “cho” và “nhận”. Sự nhân lên của plasmid tiếp hợp chỉ tạo ra plasmid với số lượng ít, và thời gian cho quá trình này dài hơn nhiều so với sự nhân lên của plasmid không tiếp hợp. Các loại men nối ADN (men ligaza), cũng như nhiều men khác tham gia đắc lực cho quá trình chuyển giao ADN và nhân lên của plasmid. Sau khi kết thúc, “lỗ hổng” trên màng tế bào của cả hai bên phải được hàn lại, tránh cho các phần tử có trong tế bào bị thoát ra. Có lẽ đó là nhiệm vụ của các protein màng tế bào, ngay sau khi sự chuyển giao ADN kết thúc. Với cơ chế nhân lên và chuyển giao như thế, plasmid chỉ chuyển một, cùng lắm là hai bản ADN vào cho tế bào nhận. Sự chuyển giao ADN (đặc biệt là chuyển giao các phân đoạn ADN hệ gen của tế bào vi khuẩn chủ) cho tế bào vi khuẩn “nhận” có thể kéo dài đến 100 phút mà không gây chết tế bào “nhận”. Tuy nhiên, nhiều khi, cùng một lúc có quá nhiều tế bào “cho”, cắm quá nhiều cầu tiếp hợp vào và chuyển ADN vào tế bào “nhận” (tỉ lệ cho : nhận quá chênh lệch), nên lượng ADN vào tế bào “nhận” bị quá tải. Trong trường hợp như vậy, tế bào “nhận” không kịp thực hiện hết quá trình tổng hợp sợi bổ sung để tạo nên ADN của plasmid mới, dần dần dẫn đến chúng bị “đột tử”. Người ta gọi sự kết hợp này là sự hình thành “hợp tử chết” (lethal zygosis), một hiện tượng khá phổ biến ở quần thể vi khuẩn, khi mà số lượng vi khuẩn có plasmid tiếp hợp nhiều hơn số lượng vi khuẩn còn nguyên làm đối tượng “nhận”. Tại sao với những lỗ hổng “to” như vậy (theo nghĩa ở tế bào) trong quá trình chuyển giao ADN, mà các thành phần trong nguyên sinh chất của tế bào không thoát ra ngoài? Nếu bị thoát ra ngoài, ngay lập tức tế bào “nhận” sẽ bị chết. Có lẽ những lỗ hổng trên màng tế bào, như những cái van, chỉ cho dòng chảy vào (ADN vào) và cản ngăn dòng chảy ra (không cho thành phần tế bào thoát ra). Plasmid tiếp hợp, mà phần lớn là plasmid F và loại giống F, ngoài những thành phần cơ bản khác, trong hệ gen của chúng có chứa một tổ hợp gen phức tạp, gọi là tổ hợp gen tra (xem phần sau), có vai trò quan trọng trong sự tạo thành lông giới tính để làm cầu tiếp hợp, cũng như tham gia vào quá trình chuyển giao ADN như đã giới thiệu. Về góc độ phân tử, có lẽ các gen traI, traM, traY và traZ chịu trách nhiệm điều hành sự chuyển giao ADN hơn là tham gia vào việc tạo thành lông giới tính để làm cầu tiếp hợp. Sản phẩm của gen traY và traZ của plasmid, có thể thành phẩm là các enzym giới hạn (gọi là endonucleaza), có tác dụng cắt ADN ở vị trí oriT, nơi bắt đầu cho sợi dương ADN của plasmid trồi ra, để thực hiện chuyển giao sợi dương qua cầu tiếp hợp. Còn sản phẩm của gen traI và traM có lẽ đóng vai trò trong điều hành vòng quay ADN cho đến khi chuyển giao sợi dương kết thúc. Gen traY là gen cấu trúc nằm ở đầu, còn gen traZ nằm ở cuối trong chuỗi gen ở tổ hợp tra, và do vậy chúng cũng là những gen cho ra sản phẩm đầu tiên và cuối cùng. Gen traM tuy định vị ở ngay trước gen traY, nhưng gen này tạo sản phẩm một cách độc lập và không phụ thuộc vào các gen khác trong tổ hợp tra.
|
TRANG CHỦ
