Việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loài vi sinh vật, trong đó có ký sinh trùng cho đến nay vẫn dựa vào chủ yếu phương pháp hình thái học (kiểu hình) là chính. Các kỹ thuật và phương pháp cổ điển đã đáp ứng được phần lớn yêu cầu về phân loại sinh vật, trong đó có ngành ký sinh trùng. Song, do ký sinh trùng đa số vốn dĩ ký sinh và gây bệnh trên động vật và gia súc nuôi, gần đây lại tăng tỷ lệ lây truyền bệnh từ động vật sang người càng ngày càng cao, phức tạp và có nhiều nhóm, loài ký sinh trùng giống nhau về hình thái nhưng khác nhau về cấu trúc gen, nên dẫn đến khác nhau về sinh lý, sinh thái và đặc tính gây bệnh. Fasciola spp. được biết đến là một trong những loài ký sinh trùng gây bệnh trên động vật phổ biến, nhất là loài động vật ăn cỏ và động vật nhai lại. Tuy khá nhiều loài Fasciolae spp/ khác nhau, song hai loài Fasciola quan trọng nhất được biết gây bệnh cho người là Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) và Fasciola gigantica (Cobbold, 1855). Hiện đã có nhiều công trình nghiên cứu nổ lực phát hiện ra các loài mới và dưới loài (subspecies) của Fasciolae từ bảng phân loại nguyên bản của hai loàiF.hepatica và F.gigantica. Các phương pháp sinh học phân tử ứng dụng công nghệ gen trong chẩn đoán, phát hiện và giám định cũng như lập phả hệ sinh vật, trong đó có ký sinh trùng đã giải quyết được những tranh luận lâu nay về hình thái học một cách thấu đáo. Các só liệu chính xác của các phương pháp sinh học phân tử đá cho phép ứng dụng những hướng mới và rất có thể sẽ làm thay đổi một phần hệ thống phân laọi về ký sinh trùng hiện có.
Nội dung ttổng hợp dưới đây nêu lên các đặc điểm, thông số, chỉ số nhằm phân biệt giữa các loài F.gigantica và F.hepatica cả về mặt hình thái học, sinh thái học liên quan giữa vật chủ - ký sinh trùng, kiểu hình, kiểu gen, đặc tính di truyền phân tử và đặc tính sinh hóa, đặc biệt các marker đặc hiệu loài thông qua một số kỹ thuật hiện đại. Tập hợp các điểm trên, các tác giả nghiên cứu đã phân biệt các loài này với nhau cực kỳ chính xác.
GIỚI THIỆU
Bệnh sán lá gan lớn (SLGL) là một trong những vấn đề y tế và bệnh ký sinh trùng quan trọng ở động vật ăn cỏ khắp thế giới, gây thiệt hại nền kinh tế nghiêm trọng, nhất là lĩnh vực thú y, và gần đây bệnh có xu hướng gia tăng có ý nghĩa trên người. Tác nhân gây bệnh của các loài khác nhau của loài SLGL phụ thuộc nhiều vào giống (genera) Fasciola và Fascioloides. Những loài Fasciola quan trọng nhất được biết là Fasciola hepatica (do tác giả Linnaeus mô tả đầu tiên 1758) và Fasciola gigantica (do tác giả Cobbold mô tả năm 1855). Những loài Fasciola khác bao gồm F.nyanzae (Leiper, 1910) được báo cáo lần đầu ký sinh trên loài hải mã ở quốc gia Uganda; F.tragelaphi (Pike và Condi, 1966) tìm thấy ở loài linh dương Sitatunga (Sitatunga-antelop) và F. Jocksoni (Cobbod, 1869) tìm thấy ký sinh trên voi. Hai loài đầu tiên tìm thấy một cách giới hạn trong những khu biệt lập của Tây Phi, loài thứ ba lưu hành ở Ấn Độ và Pakistan phổ biến. Loài Fascioloides magna (Bassi, 1875) là một loài SLGL ký sinh trên dê sống tại Bắc Mỹ, chúng có thể trở nên gây nhiễm các loài động vật ăn cỏ khác (Boray, 1982).
Một vài dẫn liệu mô tả về các loài mới và loài phụ của Fasciola từ bảng phân loại nguyên bản của hai loài chính F.gigantica và F.hepatica xuất phát từ Senegal (Railliet, 1895), ở Ai Cập (Looss, 1896), ở Mỹ (Sinitsin, 1933), ở Ấn Độ (Varma, 1953; Therpar và Tandon, 1953), ở Kenya (Itagaki và Akane, 1959), ở Uzbekistan (Gariev, 1970) và Philippin (Kimura và cs, 1984). Những loài đang nghi ngờ dường như có từ đồng nghĩa để đặt tên với Fasciola hepatica hoặc Fasciola gigantic. Nhìn chung, các nhà khoa học có thể chấp nhận để phân biệt chúng với nhau. Ngoại trừ vùng Viễn Đông có thể Fasciola tựa như thể Fasciola ở Nhật Bản, các thể này được phân loại vừa không phải F.gigantica vừa không phải F.hepatica (Agatsuma và Suzuki, 1980; Agatsuma và cộng sự, 1994); Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo sâu hơn cho biết và bổ sung một số tiêu chuẩn phân loại học (Taxonomic criteria) để định loại thể SLGL Nhật Bản này (Itagaki và Akane, 1959; Watanabe, 1965; Agatsuma và Suzuki, 1980; Agatsuma và cs, 1994) để củng cố các ý kiến trên một cách hoàn hảo.
F.hepatica có mặt khắp và phân bố rộng rãi trên khắp thế giới. Trước tiên, ở vùng ôn đới và vùng bán nhiệt đới thì có nhiều tài liệu đề cập đến nhiễm SLGL trên người, trong khi đó, F.gigantica có xu hướng xuất hiện ngày một nhiều ở vùng nhiệt đới châu Phi, châu Á và vùng Đông Nam Á song lại có ít tài liệu đề cập đến loại này hơn (Boray, 1982; Mas-Coma và Bargues, 1997; Spithill và cs, 1999). So với F.hepatica, hiện có rất ít nghiên cứu sâu tiến hành trên loài F.gigantica mặc dù hiện nayngười ta ghi nhận có xu hướng gia tăng loài này. Tuy có một số đặc điểm giống nhau giữa hai loài, song cũng có một số điểm khác biệt giữa chúng khi tiến hành định loại, việc định loại các loài sán chính xác càng bao nhiêu thì hiệu quả mang lại cho công tác phòng chống tốt bấy nhiêu. Ngoài ra, việc định loại loài SLGL còn có ý nghĩa mang lại những thông tin quan trọng về sinh học và sinh thái học ở chúng để đề ra biện pháp phòng chống bệnh này tại thực địa có hiệu quả đối với hai loài Fasciola hepatica và Fasciola gigantica.
ĐIỂM PHÂN BIỆT VỀ HÌNH THÁI HỌC VÀ SINH THÁI HỌC CÁC LOÀI SÁN( Morphological and ecological differentiation)
F.gigantica và F.hepatica có tính đa hình với nhiều yếu tố tác động lên hình thể bao gồm tuổi của sán, loài vật chủ động vật hay người, cường độ nhiễm nặng hay nhẹ (cường độ nhiễm càng cao thì sán càng nhỏ). Bên cạnh đó, khi làm tiêu bản cố định để định loại loài sán không những cho chúng ta biết rất kỹ về hình thái học, kích thước tuyệt đối mà còn cho đo được kích thước tương đối của các cơ quan khác nhau trong cơ thể vì đó cũng là các thông số đặc hiệu cho định loại (Kendall, 1965; Ternopols-Kaya, 1984). Tác giả Boray (1982) báo cáo rằng loài F.hepatica ở Australia có hình chiếc lá, dài 18-32mm, rộng 7-14mm, màu nâu xám khi còn sống, với cơ thể phẳng thuôn dài và có viền màu tối bên ngoài do manh tràng chứa đầy máu. Đoạn cuối phía trước của sán dạng một chóp hình nón và tẻ rộng ra về phía vai và rồi nó lại hẹp dần về đoạn cuối phía sau. F.gigantica có hình thể tương tự F.hepatica nhưng có kích thước lớn hơn, chiều dài 24-76mm và rộng 5-13mm. Cấu trúc hình nón phía trước giống nhau, nhưng độ rộng khó thể phân biệt với loài F.hepatica.
Tại Ai Cập-một quốc gia có tỷ lệ nhiễm loài SLGL này cao và phổ biến nhiều vùng và lại có nhiều trung tâm nghiên cứu sâu về mọi khía cạnh của bệnh, các nhà nghiên cứu phủ nhận sự hiện diện của F.hepatica ở những loài vật nuôi tại địa phương và họ cho rằng bản thân nó có là do từ những động vật nhập khẩu về (Soliman and Farid, 1960; El-Azazy và Schillhorn Van Ven, 1983; Abd-Rabo và Abou-Rawash, 1998). Giải thích điều này có thể người ta dựa vào hình thái học (morphology) và phổ hình thái (morphometry) có sự trùng lặp xen kẽ (overlap) về kích thước, song điều này không có cơ sở khẳng định. Về giải phẩu hình thái (morphoanatomy) rất đáng tin cậy và thực tế đã chứng minh sự có mặt của cả hai loài. Những con sán thu được trên gia súc trâu và bò ở Ai Cập, người ta phát hiện cả hai loài dựa vào tiêu chuẩn kích thước, song nó ngắn hơn (Lotfy và cs, 2002; Boray và cs, 1984). Ngược lại, sán trưởng thành F.hepatica thì ngắn hơn F.gigantica, do đó sán lá gan lớn loại F.gigantica trên trâu bò của Ai Cập lại dài hơn (19-41 x 6-13mm) và có phần hình thuôn ở đoạn phía sau dài hơn, trong khi ở F.hepatica thì nhỏ hơn (9-25 x 5-15mm) và có phần vai nở to hơn. Phần đầu hình nón của sán dài và rộng, chiều dài tinh hoàn cũng được xem là một yếu tố để phân biệt giữa 2 loài. Tỷ lệ giữa chiều dài-chiều rộng của sán là điểm phân biệt rất có ý nghĩa giữa hai loài sán và một phần rất nhỏ có trùng lắp nhau (tỷ lệ 1.2-2.6 đối với F.hepatica và 2.1-5.4 đối với F.gigantica). Về mặt giải phẩu học hình thể, số phân chia nhánh ruột của F.hepatica thì ít và có túi nhỏ, trong khi đó F.gigantica lại chia tầng 2 hoặc chia nhánh nhiều lần. Các nhánh của buồng trứng thì nhỏ hơn và hình gậy ở F.hepatica trong khi F.gigantica lại lớn hơn và chia nhánh phức tạp hơn. Về tinh hoàn, F.hepatica có đơn giản trong khi F.gigantica thì phức tạp, có nhiều xoang bên trong và các chất dịch keo dính chặt. Ở F.hepatica thì lớp mô mạch liên kết ở phần thắt lưng nhỏ và mỏng, trong khi của F.gigantica thì thanh mảnh, dài và rộng ở phần cuối cùng (Lotffy và cs, 2002).
Trứng của F.gigantica lớn hơn trứng của F.hepatica, khoảng cách phân biệt về kích thước trứng được báo cáo ở mỗi loài Fasciola do những tác giả trình bày khác nhau (Malek, 1980; Watanabe, 1965; Soulby, 1973; Soulby, 1978). Trên trâu và bò ở Ai Cập, trứng của F.hepatica đo được 96-169 x 65-96 µm và trứng F.gigantica là 130-175 x 77-118 µm (Lolffy và cs, 2001). Một số tác giả thì đề cập rằng nó không phải phụ thuộc vào kích thước của trứng sán mà phân biệt phụ thuộc giữa các loài khác nhau của Fasciola (Kendall, 1965; Malek, 1980). Người ta thấy rằng có sự thay đổi về kích thước trứng sán cũng như kích thước con sán trưởng thành là có liên quan đến vật chủ mà chúng ký sinh (Malek, 1980; Watanabe, 1965; Lolffy, 2001). Không có một điểm nào nghi ngờ gì liên quan đến vùng địa lý khác biệt hay dòng (strains) phát triển của ký sinh trùng. Một dòng F.hepatica được mô tả ở Hà Lan và Đức cho biết có thể phân biệt trứng sán vì chúng có kích thước lớn đáng kể. Trứng của dòng F.hepatica này tương tự như kích thước cùng dòng trên cả cừu và gia súc theo các kích thước sau: ở gia súc 146-179 x 80-100µm và ở cừu là 143-180 x 88-102µm. Trên thể miracidia, đẻ ra những trứng lớn như thế rồi cho phép nhiễm vào vật chủ ốc, sinh ra sán trưởng thành cũng với những trứng lớn như vậy trong môi trường thực nghiệm cho cừu ăn metacercariae từ dòng này (Jansen, 1972; Duwel, 1982). Trên những dòng SLGL ở Ai Cập, có một mối liên quan chặt chẽ giữa độ dài và độ rộng của trứng F.hepatica, trong khi đó thì F.gigantica lại không có liên quan này (Lotfy và cs, 2001).
Nếu ở nhiệt độ 300C, trứng của F.hepatica phải mất 7 ngày mới nở, nếu 250C thì mất 9-10 ngày và 200C thì mất 15 ngày; trong khi đó nếu ở nhiệt độ 300C, trứng của F.gigantica phải mất 11-12 ngày mới nở, nếu 250C thì mất 17 ngày và 200C thì mất 31 ngày (Watanabe, 1965). Những thích nghi đáp ứng với ánh sáng mặt trời của miracidia của Fasciola thường bị ảnh hưởng bởi thời gian sống của vật chủ là ốc. Miracidia của F.hepatica có đáp ứng dương tính (positve respond) vớiánh sáng, mang chúng trên bề mặt, trong khi đó đối với F.gigantica thì ngược lại (đáp ứng âm tính), giữ chúng nằm sâu dưới nước, nơi mà vật chủ ốc cư trú (Watanabe, 1965; Taylor, 1964; Wright, 1971). Miracidia của F.gigantica rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp; khi chúng được ủ ở 50C chúng sẽ mất lớp cilia và chỉ bò lúc nhúc ở đáy, trong khi đó miracidia của F.hepatica bơi lội rất nhanh nhẹn trong nước nếu cũng nhiệt độ như thế. Từ những nhận định về tập quán, hành vi của miracidia, người ta cho rằng F.hepatica kháng lại rất mạnh ở nhiệt độ thấp, còn F.gigantica chỉ có ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới mà thôi (Watanabe, 1965).
Giai đoạn ký sinh trong các nhuyễn thể thường bao gồm một giai đoạn sporocyte và giai đoạn redia. Có một nhận định rất rõ ràng cho rằng quá trình sinh ra các redia cái là một thiên hướng thoát khỏi điều kiện mùa đông. Khi cercaria phát triển đầy đủ, chúng lộ một lỗ ra ở gần hầu của redia hướng vào trong thân nhu mô ốc và bắt đầu tạo đường đi sao cho từ ốc vào trong nước thuận lợi (Ukoli, 1984; Kendall, 1965). Tác giả Ogambo-Ongoma và Goodman (1976) đã công bố F.gigantica không có thế hệ sporocyte tiền redia (pre-redial sporocyst generation), miracidium thay đổi hình dáng trực tiếp bên trong redia mẹ. Họ cho rằng có 4 thế hệ redia, mẻ đầu tiên của cercariae được sinh ra bởi thế hệ thứ 3. Còn tác giả Palmieri và cộng sự (1977) cho biết trong một nghiên cứu điều tra để xác định giai đoạn sporocyst là không bị sai biệt có liên quan đến quá trình phát triển bên trong loài nhuyễn thể của F.gigantica (Dinnik, 1964). Tác giả Ollerenshaw và Graham (1986) cũng đề cập đến tất cả các giai đoạn nhưng thể trẻ nhất của redia, hai loài Fasciola có thể sẵn sàng chia tách theo chiều dài và hình dáng của ruột. Redia của F.hepatica, ruột thì ngắn và có hình cầu thường chiếm 1/6 cơ thể nhưng đôi khi có thể đến 1/3 cơ thể. F.gigantica với ruột kéo dài, luôn vượt quá 1/3 chiều dài cơ thể, đôi khi chiếm 1/2 chiều dài toàn redia. Dreyfuss và Rondelaud (1997) báo cáo rằng trên ốc Lymnaea trunculata được gây nhiễm thực nghiệm, F.gigantica có chu kỳ ủ bệnh tiềm tàng dài hơn F.hepatica.
Dixon (1965) cho biết vách nang metacercaria của F.hepatica có một cấu trúc phức tạp, bao gồm 4 lớp quan trọng. Lớp I bên ngoài, bản chất là protein màu vàng sậm quinone (quinone-tanned protein), lớp II và lớp III cho phản ứng với protein và polysaccharide và lớp IV là lớp lót trong cùng, bản chất là protein keratin hóa. Ternopol’skaya (1971) đã báo cáo metacercaria của F.hepatica và F.gigantica có thể phân biệt một cách rõ ràng qua độ dày tương đối của lớp thứ III và IV của cyst bên trong (độ dày 2.9 và 2.3µm ở F.hepatica và 2.8 và 4.4µm ở F.gigantica). Tỷ lệ phần trăm mà metacercariae thả nổi ở F.gigantica lớn hơn F.hepatica, do vậy các metacercaria được xem là yếu tố quan trọng và là nguồn gây nhiễm ở các vùng mà vật chủ ốc không ổn định, do đó coi như làvùng an toàn gây nhiễm (Dreyfuss và cộng sự, 1997; Suhardono, Roberts và Copeman, Bogor, 1996). Boray và Enigk (1969) tìm thấy metacercaria của F.gigantica có khả năng sống sót dài hơn khi ở nhiệt độ cao hơn F.hepatica. Metacercariae của F.gigantica nhạy cảm với khí hậu, nhiệt độ hanh khô hơn là F.hepatica; do đó, nhiễm F.giganticabằng đường ăn là không thể hoặc rất khó xảy ra. Kết quả của nghiên cứu thực nghiệm cũng phù hợp với sự thích nghicủa F.gigantica với điều kiện nước và nhiệt độ tương đối hơn.
KIỂU HÌNH, KIỂU GEN VÀ NHỮNG KHÁC BIỆT VỀ DI TRUYỀN PHÂN TỬ
(Karyotyping, genotyping and molecular genetic differentiation)
Fasciola spp. có thể phân loại thành 3 type dưạ vào phần bổ thể của nhiễm sắc thể (chromosomal complement) các thể đơn thuần với thành phần đơn bội, nhị bội, tam bội và thể khảm (mixoploid-mosaic). Sán có 30 nhiễm sắc thể đại diện cho thể tam bội với 3 bộ 3n, mỗi bộ 10 nhiễm sắc thể, trong khi đó thể nhị bội có 20 nhiễm sắc thể và thể khảm 2n/3n (Romanenko và Pleshanova, 1975; Sakaguchi và cs, 1978; Moriyama và cs, 1979; Sakaguchi và Ueno, 1979; Sakaguchi và Kusano, 1979; Sakaguchi và cs, 1980; Sakaguchivà cs, 1980; Yin và Ye, 1990). Romanenko và Pleshanova (1975) đã nghiên cứu kiểu hình của F.hepatica và F.gigantica trước đây ở Nga và báo cáo số lượng nhiễm sắc thể của hai loài sán lá gan lớncủa Liên bang Nga này là giống nhau và cùng thể nhị bội. Tuy nhiên, chúng được phân biệt nhờ vào hình dáng và độ dài của bộ nhiễm sắc thể. Sakaguchi và Ueno (1979) tìm thấy F.gigantica từ Hawaii có bộ nhiễm sắc thể nhị bội hoặc tam bội. Yin và Ye (1990) điều tra kiểu hình nhị bội và tam bội của SLGL Trung Quốc, họ cho rằng hình ảnh của sán trưởng thành và chu kỳ sinh học của thể nhị bội thì tương tự với F.gigantica, trong khi thể tam bội lại giống với F.hepatica.
Kỹ thuật sinh học phân tử có thể giúp phân định được loài ký sinh trùng có liên quan mật thiết với nhau mà nếu chỉ dựa trên hình thái học đơn thuần họ không thể phân tách ra được. Đây là trường hợp ở SLGL của Nhật Bản và Hàn Quốc và có lẽ ở Ai Cập - nơi mà F.hepatica và F.gigantica thường trùng lắp lên nhau. Phân tích DNA enzyme phân cắt giới hạn tại các vị trí đặc hiệu trên trình tự sắp xếp của chúng sẽ cho những kết quả chính xác hơn rất nhiều. Chính vì vậy, kích thước của các đoạn mang một chức năng tuỳ thuộc kích cỡ vùng đó. Kỹ thuật này thường dùng để phân biệt giữa các loài SLGL với nhau (Michael và Trudgett, 1997; Blair và Mc Manus, 1989). Về mặt lý thuyết, mặc dù dữ liệu của giải trình tự cung cấp cho chúng ta kết quả rõ ràng về đa dạng di truyền, phiên giải các bằng chứng xác thực nhất và qua phân tích PCR giải trình tự ngắn đã cho kết quả và biết mức độ đa dạng mà chúng có thể có theotừng chức năng khác nhau của bộ gen SLGL. Giải trình tự nucleotide rất hữu ích khi phân biệt giữa các loài Fasciola spp. với nhau, chẳng hạn nucleotide của đoạn sao chép nội loài thứ phát (second internal transcribed spacer-ITS2) của gen nhân rDNA, trình tự nucleotide của NADH dehydrogenase subunit1 (ND1) và cytochrome oxydant subunit 1 (COI) của gen ty thể (Adlard và cs, 1993; Hashimoto và cs, 1997; Itagaki và Tsutsumi, 1998; Itagaki và cs, 1998).
Tại Nhật Bản và Hàn Quốc, thể tam bội Fasciola spp. đã được nghiên cứu một cách bài bản để xác định tính đặc hiệu của chúng. Trong một số bài báo, Itagaki và cs (1998) đã so sánh trình tự nucleotide của NADH dehydrogenase subunit1 (ND1) và cytochrome oxydant subunit 1 (COI) hệ gen ty thể của F.hepatica (Uruguay) và F.gigantica (Zambia) với của thể tam bội của Fasciola spp.(Nhật Bản). Họ cho biết sự khác nhau nội loài trong chuỗi trình tự nói chung là thấp, nhưng trình tự của thể tam bộiNhật Bản là tương tự với F.gigantica và khác với F.hepatica, nên về cơ bản thì Fasciola (Nhật Bản) có thể phân loại vào F.gigantica. Thứ hai, họ cho kiểm tra trình tự ITS-2 của RNA nhân sử dụng quần thể ở trên và kết luận thể tam bội (Nhật Bản được chia thành hai thể riêng biệt, một thể thì phân theo F.gigantica và còn lại phân theo F.hepatica (Itagaki và Tsutsumi, 1998). Thứ ba, Itagaki và cs (2001) đã phát hiện tính đa hình của hệ gen ty thể DNA bằng kỹ thuật men phân cắt giới hạn (Restriction fragment lengh polymorphism – RFLP) sử dụng 8 enzyme phân cắt và đã phát hiện 3 type khác nhau trong số 76 loại SLGL đã được nghiên cứu. Một sán F.hepatica (từ Uruguay) là type 1, hai sán F.gigantica (từ Thái Lan), 8 sán (từ Nhật) và 1 (từ Hàn Quốc) là type 2; hai F.hepatica (từ Úc) và 62 sán từ Nhật Bản là type 3. Các tác giả kết luận rằng thể tam bội Fasciola(Nhật Bản) là bao gồm 2 nòi giống (lineages) có một cấu trúc di truyền đã được xác định F.gigantica và F.hepatica và lai giữa hai loài. Ngoài ra, một vài dòng Fasciola của Nhật Bản và Hàn Quốc có thể bắt nguồn từ nguyên thủy chung (common ancestor). Các dữ liệu này góp phần bổ sung cho nghiên cứu về tính nhiễm mà F.hepatica và Fasciola (Nhật Bản) có tính nhiễm cao với chuột Wistar, ngược lại F.gigantica có tính nhiễm thấp (Itagaki và cs, 1994).
Tương tự, sự lai chéo nội loài giữa F.gigantica và F.hepatica được phát hiện trên các mẫu bệnh phẩm của Hàn Quốc bằng kỹ thuật giải trình tự internal-transcribed spacer 2 và vùng D2 trong phân tử 28S rDNA của DNA nhân, tương tự với những Fasciola (Nhật Bản) được tìm thấy (Agatsuma và cs, 2000).
Nói tóm lại, Fasciola tam bội (Nhật Bản) không thể định dạng được như F.hepatica hay F.gigantica dựa trên đặc điểm hình thái học. Tuy nhiên, thể tam bộ này bao gồm trong 3 quần thể khác nhau tức là giữa F.gigantica hoặc F.hepatica hoặc loài na ná giữa hai chủng (Itagaki, theo số liệu chưa báo cáo), đó là một tình huống tương tự xảy ra ở đồng bằng sông Nile ở Ai Cập vẫn có chung nguồn gốc tổ tiên.
Những nghiên cứu về Fasciolae spp. thường sử dụng kính hiển vi để phát hiện những ốc nhiễm bệnh. Tuy nhiên, độ nhạy, độ đặc hiệu và tính ứng dụng của nó vẫn còn nhiều hạn chế. Các thử nghiệm dựa trên chất liệu di truyền DNA để xác định ốc có nhiễm ấu trùng Fasciola spp. sẽ giải quyết tốt vấn đề và phát hiện với độ chính xác cao (Kaplan và cs, 1995). Giải trình tự thông qua dùng đầu dò DNA phổ biến khắp thế giới như là một công cụ dịch tễ học để kiểm tra vật chủ trung gian ốc nhiễm SLGL. Tuy nhiên, sự phân biệt nhiễm giữa F.hepatica và F.gigantica trên ốc qua sử dụng DNA Probe thì không thể (Kramer và Schnieder, 1998). Ngoài ra, ở người thật khó để phân biệt hình thể sán nhằm phân biệt giữa F.hepatica và F.gigantica nếu chỉ dựa vào kỹ năng lâm sàng, kiến thức bệnh học, xét nghiệm phân và miễn dịch học (coprological, immunological method). Thử nghiệm RFLP-PCR nhanh dùng enzyme phân cắt giới hạn AvaII và DraII được dùng để phân biệt hai loài F.gigantica và F.hepatica trên người và động vật. Dựa vào chuỗi trình tự dài 618bp của đoạn gen 28S rRNA, gần đây các tác giả đã thu được quần thể SLGL từ Nam Mỹ, châu Âu và châu Phi. Chuỗi trình tự thể hiện có vài điểm khác nhau mức độ nucleotide giữa các loài Fasciola spp và không có sự khác biệt nội loài. Kết quả này cung cấp kết quả rất mơ hồ, song có thể rất hữu ích cho chẩn đoán những cá thể và điều tra dịch tễ học trên động vật ở những vùng lưu hành (Marcilla và cs, 2002).
SỰ KHÁC BIỆT VỀ MẶT SINH HÓA (Biochemical differentiation)
Phân tích mẫu protein bằng điện di trên thạch polyacrylamide đã cho tổng quát về sự khác biệt giữa các loài Fasciola spp. khác nhau (Klimenko và Sazanov, 1972). Bằng áp dụng phương pháp tập trung đồng vị trên thạch polyacrylamide (isoelectric focusing-IEF), phức hợp di truyền có thể liên quan chặt chẽ với dữ liệu protein đặc hiệu loài. Tiếp cận lĩnh vực phân loại theo hóa học (chemotaxonomical) này cung cấp cho ta một công cụ hữu ích để phân tích các liên quan di truyền của các loài SLGL, phương pháp IEF với protein hòa tan thật đơn giản, dễ làm và tạo ra kết quả tốt, có lẽrất phù hợp với việc phân biệt loài Fasciola (Lee và cs, 1992a; Lee và cs, 1992b; Lee và Zimmerman, 1993). Việc phân tích điện di enzymeđã tỏ ra là một công cụ quan trọng để phân loại và phân biệt giữa các dòng và loài Fasciola (Probert và Durrani, 1977; Agatsuma và Suzuki, 1980; Agatsuma và cs, 1994). Tác giả Agatsuma và cs (1994) đã nghiên cứu mức độ biến đổi mẫu isozyme giữa mẫu SLGL có nguồn gốc từ Nhật Bản (31 mẫu tam bội sinh sản đơn tính), Hàn Quốc (thể nhị bội đơn dòng của chủng Fasciola chưa xác định), ở Mỹ (7 thể nhị bội của F.hepatica) và Úc (30 thể nhị bội của F.hepatica). Mức độ thay đổi này được phát hiện tại 5 locus enzyme Ak (Adenylate kinase), Got (Glutamic-oxaloacetic transaminase), Gpi (Glucose-phosphate isomerase), 6-Pgd (6-phosphate gluconate dehydrogenase) và Pgm (Phosphoglucomutase). Trên nền tảng hình thái học giun sán của Nhật Bản, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra sinh sản đơn tính, cho thấy 3 mẫu isozyme khác nhau, các loài Fasciola spp. (Nhật Bản) có thể tách ra từ 3 loài này: tương tự với F.hepatica trong các thể ngắn và không có phần vai, thể trung gian có một đuôi nhọn và có thể giống với loài F.indica. Mỗi loại trong số 3 isozyme mang một dáng dấp, một loại hình thái khác hẳn. Điều này có thể chỉ ra thể tam bội tăng hơn một lần so với sán lá gan Nhật Bản. Các con sán từ dòng của phòng thí nghiệm xuất phát từ thể tam bội Hàn Quốc đơn dòng giống như của Nhật Bản về kiểu gen và có liên quan mật thiết hơn các mẫu thu thập từ Mỹ, Úc.
Lotfy và cs (2002) sử dụng protein hòa tan trong phương pháp IEF để phân biệt giữa loài F.gigantica và F.hepatica, bằng cách so sánh kết quả điện di trên thạch với kỹ thuật phân biệt hình thái học, phổ hình thái và giải phẩu hình thái. Họ xác định có sự hiện diện cả hai loài Fasciola ở Ai Cậptừ sự lai tạo giữa hai loài được phát hiện ở trên.
SỰ KHÁC BIỆT LIÊN QUAN GIỮA KÝ SINH TRÙNG VÀ VẬT CHỦ(Host-parasite relationship differentation)
Khẳng định rằng vector của Fasciola spp. nằm trong phạm vi loài ốc của genus Lymnaea. Sự lây truyền của sán lệ thuộc giới hạn một số loài ốc và thường mỗi vùng có một loại ốc liên quan. Ngoài ra, việc nhận định các loài ốc này còn chưa rõ ràng do các nhà khoa học nghi ngờ về số lượng loài Fasciola spp. được xác định; hơn nữa họ rất khó khăn trong việc xác định toàn bộ họ ốc Lymnaeidae. Kendall (1954) đã cho biết trên khắp thế giới,việc kiểm nghiệm lại các vector một cách hệ thống sẽ giúp chỉ ra rằng F.hepatica được lây truyền do ốc Lymnaea trunculata hoặc do ốc không cùng một hệ sinh thái và hình thái đã được định danh. Về khía cạnh của F.gigantica, tất cả ốc trung gian dường như lệ thuộc vào superspecies Lymnaea auriacularia. Sự phân ranh giới giữa hai nhóm ốc có thể dựa trên nền tảng cơ bản hình thái học và việc phân biệt cũng nên nghĩ đến khi có sinh thái khác nhau. Môi trường của hai nhóm Lymnaeids là khác nhau, điều này khẳng định chắc chắn hơn nữa trên chu kỳ sinh học của bệnh sán lá gan lớn. Vector của F.hepatica là các loài sống lưỡng cư, lội và cư trú dưới bùn, có khả năng sống thường xuyên và dễ dàng thích nghi với cuộc sống khi chúng bò lên cạn. Do đó, tất cả giai đoạn của ốc (trứng, ốc non và ốc trưởng thành) có thể chịu đựng điều kiện khô hạn trong thời gian cho phép. Ngược lại, những vector của F.gigantica lại sống hoàn toàn dưới nước (Kendall, 1965). Nói chung, vật chủ trung gian ốc của F.hepatica và F.gigantica dường như khác biệt hoàn toàn. Các con ốc thường dễ tiếp nhận/ nhạy cảm với F.hepatica thì lại đề kháng với F.gigantica và ngược lại. Tuy nhiên, các con ốc chưa trưởng thành đề kháng hoàn toàn cho đến khi chúng trường thành thì dễ bị nhiễm thường xuyên và sự nhiễm này có thể thúc đẩy đến quá trình thuần thục cơ thể chúng (Kendall và Parfitt, 1959; Boray, 1969; Boray, 1966; Cruzz-Reyes và Malek, 1987). Yêu cầu đặc biệt để vật chủ lây nhiễm 2 loài sán lên người thì F.gigantica ít hơn F.hepatica, đây có thể là một đặc điểm đặc thù trong quá trình thích nghi. Vấn đề này mở ra hướng nghiên cứu vì sao F.gigantica lại ổn định hơn F.hepatica và nơi cư trú của chúng thường là các vùng khí hậu ôn đới của khu vực Bắc bán cầu. Tuy nhiên, sự xuất hiện F.hepatica và ốc L.trunculata vào trên hầu hết các vùng lưu hành F.gigantica có thể do một sự bùng phát riêng biệt nào đó (Boray, 1966). Chẳng hạn, F.gigantica được cho là do gia súc ở người Bà la môn (Brahmin) nhập khẩu vào vùng lưu hành của F.hepatica ở bờ biển/ vịnh của Nam Mỹ; qua nhiều nghiên cứu cho thấy nếu vùng có nhiễm phối hợp F.gigantica và F.hepatica dẫn đến xuất hiện các loài sán có những đặc điểm hình thái học trung gian (Price, 1953).
Đề cập đến loài ốc trung gian truyền bệnh SLGL ở Ai Cập, L.natalensis (L.cailliaudi), L.trunculata, L.columella và L.satgnalis được báo cáo ở Ai Cập. Riêng L.natalensis được báo cáo ở vùng dưới và giữa của Ai Cập; Giza và Fayoum (Nagaty và cs, 1959; Nagaty và cs, 1962; Frandssen, 1983. Tác giả Leiper (1916) phát hiện L.trunculata với số lượng lớn trên đảo Gezireh, vườn bách thú và vùng Bilbeis. Pallary (1924) báo cáorằng L.trunculata được phát hiện khắp nơi ở sông Nile, Ai Cập. Tuy nhiên, tác giả Nagaty và cọng sự (1959) đã thu thập hàng nghìn con ốc L.trunculata trưởng thành từ các giếng của vùng ốc đảo Baharia, nhưng không thể thu thập chủng này từ thung lũng Nile tại Ai Cập. L.columella và L.satgnalis được giới chuyên môn nghi ngờ đóng vai trò vật chủ trung gian của F.hepatica. Ốc L.columella được báo cáo có mặt ở Kafr El-Sheikh, Qualiubia và Giza Governorates, trong khi đó L.satgnalis được báo cáo có mặt ở Wadi-El-Natroun (Nagaty và cs, 1959; Nagaty và cs, 1962; Frandsen, 1983). Farag và El-Sayad (1995) cho biết có sự xuất hiện của ốc Biomphalaria alexandrina nhiễm tự nhiên với loài F.gigantica. Dòng F.gigantica của Ai Cập bị gây nhiễm trên mô hình thực nghiệm ở 1-2 tuần tuổi (khi đó kích thước chỉ 3-5 mm) trong ốc L.natalensis thì tỷ lệ nhiễm là 100%. Trong khi đó F.hepatica lại không nhiễm ở 1-2 tuần tuổivớiốc L.natalensis, nhưng lại nhiễm vào ốc L.natalensis 1-2 ngày tuổi và tỷ lệ nhiễm này thấp chỉ 4.5%. Có thể kết luận rằng F.gigantica thích ứng tốt hơnvới ốc trung gian L.natalensis so với loài F.hepatica. Mặc dù, ốc trưởng thành L.natalensis rất khó gây nhiễm thực nghiệm với F.hepatica, song ốc chưa trưởng thành có thể nhiễmvà nhiễm tiếp theo liên tục đến giai đoạn thuần thục (Lotfy và cs, 2001).
Nhìn chung, trên gia súc và vật nuôi như cừu, dê và thỏ thì giai đoạn tiềm tàng của F.gigantica là dài hơn của F.hepatica (Watanabe, 1965). Đối với gia súc thì thường đề kháng hơn ở cừu đối với cả F.gigantica và F.hepatica (Boray, 1969). Mức độ nhiễm F.gigantica ở gia súc cao hơn so với F.hepatica và thời gian nhiễm lại dài hơn (Hammond, 1975). Trên gia súc, F.hepatica nhiễm ít hơn nhưng khả năng gây bệnh cao hơn F.gigantica và trong đó bò được xem là vật chủ đặc hiệu cho F.gigantica; nói một cách khác, F.gigantica là một ký sinh trùng dễ thích ứng với gia súc hơn là F.hepatica (Davtyan, 1956). Hai tác giả Keck và Suppere (1966) cho biết sự can xi hóa đường mật là do sự phục hồi tự phát và phản ứng viêm tái đi tái lại liên tục giữa con F.hepatica với gia súc (Keck và Suppere, 1966). Sự phát triển của F.hepatica bị dừng lại ở nhiều phase khác nhau sau khi vào cơ thể thỏ; so với cừu và gia súc, thỏ có thể loại bỏ trứng của F.hepatica và diễn tiến ít có khả năng phát triển thành miracidia, nên các miracidia này khó có khả năng tiến triển đến thể gây nhiễm vào vật chủ trung gian (Duwel, 1980). Trứng F.hepatica bị đào thải bởi vật chủ thì khác nhau; trứng lớn hơn ở các vật chủ thường gặp nhất như là gia súc, cừu hơn là các vật chủ không thường xuyên như thỏ. Sự khác biệt về kích cỡ của trứng có thể liên đới đến chu trình tiến triển thành miracidia ở những vật chủ quen thuộc khác (Abous và cs, 1998).
Tại Ai Cập, cả F.gigantica và F.hepatica cùng tồn tại trong các vật nuôi với tỷ lệ nhiễm lên đến 90% trong một số vùng (Farag, 1998). Trâu, dê, cừu, lừa, ngựa và lạc đà được các tác giả báo cáo như là vật chủ của Fasciola spp. với mức độ nhạy cảm khác nhau (El-Refaii, 1993; El-Magdoub và cs, 1999; Haridy và Morsy, 2000; El-Shazly và cs, 2002; Mazyad và El-Nerm, 2002; Haseeb và cs, 2002; Haridy và cs, 2002).
SÁN LÁ GAN LỚN Ở NGƯỜI (Human Fascioliasis)
Bệnh SLGL ở người được ghi nhận nhiều quốc gia châu Âu, châu Á, châu Mỹ , châu Phi và Ấn Độ. Một nghiên cứu phân tích toàn cầu mong rằng chỉ ra mối liên quan giữa bệnh SLGL ở động vật và ở người chỉ mới dừng lại mức cơ bản. Mặc dù, trên thực tế nhiễm SLGL ở người không hiếm ở những vùng có động vật có vú ăn cỏ nhiễm, tỷ lệ nhiễm ở người cao hay thấp không liên quan đến tỷ lệ nhiễm của động vật thấp hay cao. Chẳng hạn,ở các vùng lưu hành nặng và vừa Bolivia và Peru- nơi mà bệnh SLGL ở người và động vật cùng tồn tại, khi so sánh với những nước như Uruguay, Argentina và Chile thì SLGL ở người chỉ mức độ rải rác hoặc lưu hành thấp, trong khi bệnh SLGL ở vật nuôi thì rất phổ biến (Hillyer và cs.,1992; Hillyer và cs.,1996; Hillyer và Apt, 1997; Mas-Coma và cs.,1997). Bệnh SLGL ở người do F.hepatica thường có phản ứng các mô và gây can xi hóa đường mật do tồn tại một lượng nhỏ sán và trong cơ thể gia súc có sự phục hồi tự phát của sán thường xuyên, gây xơ hóa (Boray, 1969). Người không phải là vật chủ thích hợp vì hầu hết sán di chuyển đều bị bắt giữ ở nhu mô gan mà không có thời gian đi đến ống mật (Acosta-Ferreira và cs, 1979). Ngược lại, tác giả Mas-Coma và cộng sự (1997) cho biết ít nhất ở vùng lưu hành nặng, ký sinh trùng sẽ thích nghi dễ dàng với vật chủ người hơn là vật chủ động vật. So với F.hepatica, thì F.gigantica dường như nhiễm ít hơn và ít thích ứng hơn với vật chủ người. Trong thực hành lâm sàng, người ta thống kê F.gigantica gây ra các tổn thương lạc chỗ hơn F.hepatica (Boray, 1966; Sewell, 1966; Hammond, 1974).
BỆNH SLGL Ở NGƯỜI LÀ MỘT ĐỘT BIẾN HAY MỘT VẤN ĐỀ Y TẾ BỊ LÃNG QUÊN? (Is human fascioliasis -an emerging or an ignored public health problem?)
Mãi đến gần đây, một số báo cáo về SLGL trên người tại Ai Cập cho rằng chỉ là rải rác, trứng sán được phát hiện trên những xác người ở Ai Cập và từ đó người ta xác định là có bệnh SLGL ở người Ai Cập cổ đại từ khi đó (David, 1997). Sau gần 100 năm, đến 1928 có hai ca và năm 1958 có 11 ca bệnh SLGL ở người được chẩn đoán ở Ai Cập (Kuntz và cs.,1958; Farag và cs., 1998).
Năm 1974, tác giả Ali và cộng sự báo cáo 8 ca ở Dakahlia Governorate nhiễm F.gigantica. Thực tế, trước 1978 thì một số ca chỉ rải rác và chúng được coi như là chẩn đoán nhầm và tình trạng này xảy ra khi ăn phải những gan bò bịnhiễm (Hillyer, 1998; Farag, 1998). Năm 1978, Ragab và Farag chẩn đoán lần lượt ra 5 ca nhiễm SLGL thật sự. Bằng cách truy tìm nguồn gốc nơi sinh sống của bệnh nhân ở một ngôi làng tại Abis gần vùng Alexandria (một vùng lưu hành bệnh SLGL ở người). Họ kết luận rằng trứng SLGL có thể được phát tán khắp nơi trên đất nước này như y văn đã đề cập, nhưng tất cả số ca trên được nghĩ rằng là do nhiễm lạc chủ(spurious infection) nên vấn đề SLGL ở người khi đó được coi là vấn đề nhỏ ở Ai Cập mà thôi (Ragab và Farag, 1978). Sau đó, bệnh lan rộng trên những động vật có vú ăn cỏ được thu thập báo cáo do Halawani và Gindy (1957) và kết quả nhiễm chủ yếu là do loài F.gigantica và chỉ có một trường hợp ở ốc đảo là nhiễm F.hepatica.
Năm 1979, Farag và cộng sự thực hiện một nghiên cứu dịch tễ học khác ở làng AbisII. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở người khoảng 7.3%. Chẩn đoán được xác định trong hầu hết các ca. Kích thước của trứng sán thu thập được từ mẫu phân cho kết quả nghĩ đến loài F.hepatica. Khi đó với những dữ liệu quan trọng, họ cảnh báo rằng kết quả trên cho thấy vấn đề SLGL ở người tại Ai Cập đòi hỏi những nổ lực lớn đánh giá tầm cỡ của vấn đề vì bệnh có xu hướng lan rộng.
Năm 1983, Mansour và cộng sự điều tra thêm về ngôi làng này, với kỹ thuật soi phân họ đã phát hiện 30 bệnh nhân nhiễm SLGL trong tổng số 800 mẫu thu thập được (chiếm 3.75%). Đứng về thuật ngữ loài SLGL, họ báo cáo có 20/30 bệnh nhân là có trứng F.hepatica, 8 ca là trứng của F.gigantica và 2 ca còn lại là có cả trứng hai loài trên.
Năm 1997, El-Bahy nghiên cứu vấn đề SLGL ở Kafr El-Sheikh Goverorate ở phía tây bắc đồng bằng sông Nile. Ông ta phân lập một số trứng của Fasciola spp. từ phân của lừa và người. Mặc dù ốc L.trunculata và L.natalensis đều có khả năng phơi nhiễm với miracidia, song chỉ có ốc L.natalensis bị nhiễm mà thôi. Sau khi thỏ nhiễm chỉ có F.gigantica là phát triển, nên ông ta kết luận rằng loài gây nhiễm trên người và lừa chính là F.gigantica, sau đó ông ta còn bổ sung thêm các ca nhiễm ở người không phải vùng đất cát của Ai Cập và được báo cáo từ trước đến nay không có ốc L.trunculata ở đó (giống như vùng Abis). Tuy nhiên, ốc L.trunculata được tìm thấy có liên quan đến đất cát và vùng không đất cát ở Ai Cập (Leiper,1916; Pallary,1924; Nagaty và cs.,1959).
Đến nay, bệnh SLGL đã có mặt khắp địa bàn của châu thổ sông Nile, vài vùng phía trên của Ai Cập, thành phố Alexandria và trên sa mạc. Những nghiên cứu trong một vài làng ở Ai Cập có biểu hiện bệnh SLGL với tỷ lệ từ 2-17%. Quần thể nguy cơ nhiễm SLGL ở Ai Cập khoảng 27 triệu người. Theo số liệu ước tính trên toàn quần thể thì tỷ lệ mắc SLGL là 3%, tức là khoảng 830.000 người (WHO, 1995; Farag, 1998) Lotfy và cộng sự (2001) đã nghiên cứu trứng sán thải ra trong phân của 51 người của vùng Abis, họ thấy kích thước của trứng chừng 139 x 80µm và thiên về loài F.hepatica. Ngoài ra, có một mối tương quan thuận giữa kích thước (dài và rộng) của trứng sán phân lập từ phân người, tương quan này tương tự như kích thước của trứng F.hepatica trên động vật nhiễm. Trứng Fasciola spp. thì không phù hợp với nhiễm của ốc L.natalensis. Việc đưa ra nhận định F.hepatica được tìm thấy ở đồng bằng sông Nile, châu Âu và các quốc gia khác- nơi mà F.hepatica được tìm thấy trên các động vật nhập khẩu nghi ngờ (Soliman và cs., 1998). Sự phát triển của các loài trung gian Fasciola cũng được báo cáo ở Mỹ và Nhật Bản, bởi vì cùng tồn tại cả hai loài F.gigantica và F.hepatica (Price và cs.,1953; Agatsuma và cs.,1994). Sự có mặt của các thể trung gian như thế ở Ai Cập được cho là có thể nhưng chưa khẳng định chính xác (Lotfy và cs., 2002).
Việt Nam mới bắt đầu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, công nghệ gen trong lĩnh vực ký sinh trùng và đặc biệt nghiên cứu về sán lá gan lớn trong 10 năm trở lại đây, đến nay đã có một số thành tựu đáng kể. Hy vọng trong thời gian đến, sinh học phân tử sẽ tiếp tục nghiên cứu kiểu gen, giải trình tự sẽ giúp giải quyết và đưa ra những dữ liệu chính xác trong chẩn đoán về hình thái học hiện nay và xây dựng được bản đồ gen của các loài ký sinh trùng lưu hành tại Việt Nam.