Hình 1. A ) Trình tự nucleotide cho gen mục tiêu Pvmdr 1 (Số hiệu AY571984.1). Các mũi tên chỉ trình tự của các mồi F3, B3, FIP và BIP được thiết kế dùng trong nghiên cứu cho LAMP. Đột biến điểm được đánh dấu màu vàng (T958M → ACG-ATG) được chèn vào đầu 3' của FIP trong các mồi đặc hiệu cho đột biến. ( B ) Sơ đồ biểu diễn các mồi LAMP được thiết kế F3, B3, FIP (F1c + F2) và BIP (B1c + B2) đặc hiệu để khuếch đại kiểu hoang dã (T958) và đột biến (958M). Trình tự F1c và B1c bổ sung cho F1 và B1.
Nguồn: https://www.nature.com/articles/s41598-024-76479-7
Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vòng lặp (LAMP) là một công cụ phân tử có độ nhạy cao, dễ sử dụng tại hiện trường để phát hiện các trường hợp nhiễm KSTSR không triệu chứng với mật độ thấp.Phương pháp này thường cho kết quả tốt hơn so với kính hiển vi (KHV) và các xét nghiệm chẩn đoán nhanh (RDT), nó cho phép khuếch đại DNA KSTSR (<1 giờ), ở nhiệt độ không đổi, lý tưởng cho việc sàng lọc tại thực địa và thúc đẩy nhanh tiến trình loại trừ bệnh sốt rét (LTSR). LAMP được coi là một, nếu không muốn nói là công nghệ đột phá quan trọng nhất, cho việc giám sát phân tử và cuối cùng là loại trừ bệnh sốt rét ở những khu vực có tỷ lệ nhiễm bệnh không triệu chứng cao.Với các ưu điểm và hiệu năng chính:
Độ nhạy: Phương pháp LAMP phát hiện mật độ KSTSR rất thấp (0,5-0,05 KST/µL), tương đương với PCR và vượt trội hơn nhiều so với phương pháp soi kính hiển vi;
Phát hiện nhiễm KSTSR không triệu chứng: Các nghiên cứu cho thấy LAMP có thể phát hiện bệnh nhân sốt rét không triệu chứng với độ nhạy trên 90% so với PCR, giúp cải thiện đáng kể tỷ lệ phát hiện trong các cuộc khảo sát cộng đồng;
Khả năng ứng dụng thực tế: LAMP không yêu cầu các thiết bị chu kỳ nhiệt phức tạp, cho phép sử dụng với các khối gia nhiệt di động chạy bằng pin và khả năng quan sát trực quan (ví dụ: thay đổi màu sắc hoặc huỳnh quang);Lý tưởng cho các chiến dịch sàng lọc và điều trị hàng loạt (MSAT) để xác định và điều trị người mang KSTSR không triệu chứng, người đóng vai trò là nguồn lây truyền.
Tốc độ: Kết quả thường có trong vòng 1-3 giờ.
Bộ dụng cụ thương mại: Ví dụ bao gồm bộ dụng cụ Loopamp™ MALARIA Pan/Pf và nền tảng Alethia® Malaria (trước đây là Illumigene), đã được sử dụng để chẩn đoán tại chỗ;
Hạn chế: Mặc dù đơn giản hơn PCR, LAMP vẫn cần các phương pháp chiết tách DNA hiệu quả để đạt độ nhạy tối đa, và một số thành phần có thể cần bảo quản lạnh.
Nghiên cứu thí điểm tại Lào
Gần đây, nhóm tác giả Taofic Bouwe và cộng sự tiến hành điều tra tình trạng sốt rét không triệu chứng tại huyện Nong, tỉnh Savannakhet, Lào trong bối cảnh Lào đang tiến gần đến mục tiêu LTSR, việc giải quyết các trường hợp nhiễm sốt rét không triệu chứng vẫn là một thách thức. Các biện pháp kiểm soát tập trung vào người có triệu chứng thì lại không hiệu quả đối với các trường hợp nhiễm KSTSR không triệu chứng, vốn thường không được phát hiện bằng các công cụ chẩn đoán thông thường. Do đó, việc hiểu rõ gánh nặng của bệnh sốt rét không triệu chứng là rất quan trọng để có những biện pháp can thiệp phù hợp nhằm loại trừ căn bệnh này.
Nghiên cứu đánh giá tỷ lệ nhiễm sốt rét không triệu chứng cùng các yếu tố nguy cơ liên quan tại một huyện lưu hành bệnh ở tỉnh Savannakhet từ tháng 3 năm 2024, nghiên cứu cắt ngang đã được tiến hành tại ba làng thuộc huyện Nông. Mẫu máu được lấy từ đầu ngón tay của người tham gia để xác định KSTSR Plasmodium spp. bằng phương pháp soi lam dưới KHV và khuếch đại đẳng nhiệt vòng lặp (LAMP). Những người từ 13 tuổi trở lên cũng được phỏng vấn, kiểm định Mann-Whitney U và kiểm định chính xác Fisher được thực hiện để so sánh giá trị trung vị các nhóm tuổi và nhiệt độ khác nhau, đồng thời xác định mối liên hệ giữa các biến dự báo và biến kết quả.
Hình 2. Phiên giải kết quả xét nghiệm LAMP trong chẩn đoán sốt rét
Nguồn: https://link.springer.com/article/10.1186/s13071-021-04764-9
Tổng cộng có 622 người tham gia khảo sát này, KSTSR Plasmodium spp. được phát hiện là 2,1% (13/622) trong tổng số các người tham gia xét nghiệm. Tỷ lệ mắc sốt rét không triệu chứng 1,8%(11/622). Plasmodium vivax chiếm 15,4% (2/13) tổng số ca dương tính. Các loài còn lại không thể xác định được (undetermined species). Nông dân từ 15 tuổi trở lên chiếm 81,8% số ca nhiễm không triệu chứng. 90% người tham gia sử dụng màn chống muỗi đốt trong làng. Trong số những người được phỏng vấn, có 23,6% cho biết không sử dụng màn chống muỗi trong rừng; 21,3% số người tham gia từng đến rừng là công nhân làm việc ban đêm trong rừng.Nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ nhiễm sốt rét không triệu chứng là 1,8% tại các khu vực nghiên cứu, phần lớn tập trung ở nông dân, và một tỷ lệ đáng kể trong số những người này không sử dụng các biện pháp bảo vệ trong rừng. Những phát hiện này cho thấy các ổ chứa mầm bệnh sốt rét rất đáng chú ý do thiếu các biện pháp bảo vệ, điều này có thể đe dọa các nỗ lực kiểm soát và loại trừ bệnh sốt rét. Do đó, việc loại trừ bệnh sốt rét ở Lào vào năm 2030 cần có các biện pháp can thiệp nhắm vào nhóm dân số trưởng thành có nguy cơ cao để sàng lọc bằng các công cụ nhạy bén, kết hợp với việc nâng cao nhận thức về các biện pháp bảo vệ và bệnh sốt rét không triệu chứng.
Sốt rét là một bệnh ký sinh trùng (KST) vẫn là mối đe dọa quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng. Năm 2022, khoảng 249 triệu trường hợp sốt rét đã được ghi nhận ở các quốc gia có lưu hành sốt rét (LHSR). Lào là một trong những quốc gia có sốt rét ở Tiểu vùng Sông Mê Kông mở rộng ở Đông Nam Á. Với dân số ước tính là 7,3 triệu người vào năm 2021, tỷ lệ mắc sốt rét trên 1.000 dân số có nguy cơ ở Lào trong cùng năm là 1,7 cao hơn một chút so với năm 2020 (1,5). Dù các trường hợp sốt rét được ghi nhận và báo cáo bởi các cơ sở y tế quanh năm, nhưng số ca mắc bệnh đang tăng lên và đạt đỉnh điểm trong mùa mưa. Mặc dù P. falciparum từ lâu đã chiếm ưu thế, nhưng tỷ lệ nhiễm P. vivax gần đây đang tăng lên. Một số yếu tố nguy cơ nhiễm sốt rét đã được báo cáo từ Lào là các nhóm có nguy cơ cao nhất là những người sống trong lán trại vào ban đêm mà không có màn tẩm hóa chất diệt côn trùng (INT), các dân tộc thiểu số, cư dân vùng sâu vùng xa, vùng đồi núi và vùng ven rừng, và những người làm việc trong rừng vào ban đêm. Binh lính cũng có nguy cơ mắc sốt rét do huấn luyện hoặc tuần tra và đóng quân trong rừng, đặc biệt là dọc biên giới quốc gia.
Các biện pháp phòng chống sốt rét (PCSR) ở nước này chủ yếu bao gồm sử dụng màn ngủ tẩm hóa chất diệt côn trùng và quần áo dài tay. Trong 10 năm qua, Lào đã đạt được tiến bộ đáng kể trong việc kiểm soát bệnh sốt rét bằng cách giảm 80% số ca mắc (từ 2016-2020) và không có trường hợp tử vong nào liên quan đến bệnh sốt rét được báo cáo kể từ năm 2018.Mặc dù có những tiến bộ đáng kể, song vẫn còn những thách thức cản trở việc LTSR vào năm 2030 theo đề ra của chính phủ Lào và Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG). Một trong số đó là các ca nhiễm Plasmodium spp. không triệu chứng ở các tỉnh phía Nam, bao gồm cả tỉnh Savannakhet. Một nghiên cứu được thực hiện tại tỉnh này vào năm 2015 đã báo cáo 20% (175/888) các trường hợp nhiễm KSTSR không triệu chứng. Những trường hợp nhiễm KSTSR này bị bỏ sót khi soi kính hiển vi và xét nghiệm chẩn đoán nhanh do mật độ KSTSR (< 50 KSTSR/µl).
Một thách thức khác là phát hiện ca bệnh thụ động, theo đó những người có triệu chứng được phát hiện tại các CSYT. Cách tiếp cận này không hiệu quả trong việc phát hiện những người không có triệu chứng, những người khó có khả năng đến CSYT do không có triệu chứng. Do đó, những người không có triệu chứng tạo thành ổ chứa bệnh sốt rét và là nguyên nhân lây lan bệnh sốt rét, bởi vì muỗi Anopheles spp. hút máu từ họ có thể bị nhiễm bệnh và tiếp tục lây truyền sốt rét. Vì vậy, ở các quốc gia gần LTSR như Lào, các phương pháp thay thế là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây truyền. Một trong những phương pháp đó là phát hiện ca bệnh chủ động bằng cách sử dụng các công cụ chẩn đoán có độ nhạy cao để tìm ra các “cụm người không có triệu chứng” và điều trị cho họ.Theo định nghĩa của TCYTTG, phát hiện ca bệnh chủ động là việc nhân viên y tế phát hiện các trường hợp nhiễm sốt rét ở cấp cộng đồng và hộ gia đình trong các nhóm dân số được coi là có nguy cơ cao. Phát hiện ca bệnh chủ động có thể bao gồm hai cách tiếp cận khác nhau: (i) Cách thứ nhất, phát hiện ca bệnh lại (RACD) là quá trình tìm kiếm các trường hợp khác sau một ca bệnh chỉ điểm được phát hiện một cách thụ động;(ii) Cách thứ hai, phát hiện ca bệnh chủ động bao gồm việc sàng lọc cộng đồng có nguy cơ mà không cần kích hoạt bất kỳ ca bệnh sốt rét nào. Chiến lược PACD được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại là sàng lọc những người sống ở các khu vực có nguy cơ cao để phát hiện các trường hợp nhiễm KSTSR không triệu chứng và có mật độ KSTSR thấp. Khả năng của cách tiếp cận này trong việc tìm ra người mang Plasmodium spp. không triệu chứng phụ thuộc vào độ nhạy của công cụ chẩn đoán được sử dụng.
Do độ nhạy hạn chế của các xét nghiệm chẩn đoán thông thường (kính hiển vi và xét nghiệm chẩn đoán nhanh sốt réthay RDT) và chi phí cao cũng như kỹ năng kỹ thuật cần thiết cho phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), nên cần phải sử dụng các phương pháp phân tử như khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng lặp (LAMP). LAMP là một kỹ thuật chẩn đoán phân tử đơn giản và có độ nhạy cao được thiết kế để khuếch đại nhanh chóng và đặc hiệu DNA mục tiêu ở nhiệt độ không đổi. Nó có thể phát hiện 1-2 bản sao DNA Plasmodium mỗi phản ứng, tương ứng với 1-2 Plasmodium spp. trên mỗi µl máu. Không giống như PCR, phương pháp LAMP không yêu cầu quá trình chiết xuất DNA ban đầu tốn nhiều công sức, chu trình nhiệt trong phản ứng, nhiều lần thực hiện, kỹ năng cao và thiết bị phức tạp, đồng thời có độ nhạy tương tự như PCR. Hơn nữa, phương pháp LAMP dễ thực hiện hơn, rẻ hơn và nhanh hơn so với PCR. Ngoài ra, tất cả thuốc thử cho LAMP dùng cho bộ dụng cụ xét nghiệm sốt rét (Bộ dụng cụ phát hiện sốt rét Loopamp™, Eiken Chemical, Co. Ltd., Nhật Bản) đều có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Mặc dù các biện pháp can thiệp mới, bao gồm cả việc sử dụng thuốc nhắm mục tiêu (TDA) đã được đưa vào để kiểm soát bệnh sốt rét ở miền Nam của Lào từ năm 2022, nhưng chưa có nghiên cứu dựa trên cộng đồng nào gần đây được tiến hành để đánh giá tỷ lệ nhiễm sốt rét không triệu chứng và các yếu tố liên quan, điều này có thể giúp hiểu rõ hơn về “hồ sơ an toàn”. Hơn nữa, mặc dù một số nghiên cứu khuyến nghị sử dụng phương pháp phát hiện ca bệnh chủ động và phương pháp LAMP để phát hiện người mang mầm bệnh Plasmodium spp. không triệu chứng ở các quốc gia đang hướng tới việc LTSR, nhưng chưa có báo cáo nào về việc phát hiện ca bệnh chủ động bằng phương pháp LAMP để tìm ra các cụm cá thể mắc sốt rét không triệu chứng trong số các quần thể có nguy cơ ở Lào.Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá tỷ lệ nhiễm KSTSR không triệu chứng và các yếu tố nguy cơ liên quan qua sử dụng phương pháp LAMP, đồng thời đánh giá các biện pháp phòng ngừa và hành vi nguy cơ trong cộng đồng nông thôn huyện Nông. Kết quả của nghiên cứu này sẽ góp phần hiểu rõ hơn về nhiễm sốt rét không triệu chứng trong cộng đồng có lưu hành sốt rét ở Lào. Cuối cùng nó sẽ góp phần đẩy nhanh tiến độ LTSRvào năm 2030.
Hình 3. Mô tả quy trình thử nghiệm Malaria Pan/Pf/Pv/IC LAMP-MS
Nguồn: https://link.springer.com/article/10.1038/s41598-025-92935-4/figures/1
Đây là một nghiên cứu cắt ngang dựa trên cộng đồng nhằm đánh giá tỷ lệ nhiễm KSTSRPlasmodium spp. không triệu chứng và các yếu tố liên quan, cũng như các biện pháp phòng ngừa và hành vi nguy cơ trong cộng đồng nông thôn huyện Nông, thực hiện trong mùa khô từ ngày 1 đến ngày 6 tháng 3 năm 2024 tại huyện Nông, tỉnh Savannakhet.Theo Trung tâm Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng học (CMPE), Bộ Y tế Lào, năm 2022 và 2023, lần lượt có 140 và 30 trường hợp mắc sốt rét được ghi nhận tại huyện này bởi các trung tâm y tế thông qua phương pháp phát hiện thụ động. Tỷ lệ mắc ký sinh trùng hàng năm (API) tại huyện là 4,1 trường hợp/1000 dân vào năm 2022 và 0,88 trường hợp/1000 dân vào năm 2023, với các loài phổ biến là P. falciparum và P. vivax.Cuộc khảo sát được tiến hành tại 3 làng gồm Asing Na, Paliangkao và Laou, nằm trong khu vực phục vụ của ba TTYT Asing, Denvilai và Nakong. Các làng này được lựa chọn dựa trên các tiêu chí sau:
- Sự chiếm ưu thế của các dân tộc thiểu số (Măng và Tri) – nhóm người dễ bị tổn thương bởi bệnh sốt rét;
- Và sự thiếu vắng của việc sử dụng thuốc có định hướng (TDA).
Đối tượng nghiên cứu là nhóm người tham gia sống tại các điểm nghiên cứu được chọn. Tiêu chí lựa chọn bao gồm tất cả cư dân sẵn sàng tham gia nghiên cứu, ngoại trừ trẻ em dưới 2 tuổi và bệnh nhân đang điều trị. Một bảng câu hỏi về các biện pháp phòng ngừa sốt rét và hành vi rủi ro đã được phát cho những người tham gia từ 13 tuổi trở lên. Trong bối cảnh nông thôn Lào, trẻ em dưới 13 tuổi tham gia vào nhiều hoạt động khác nhau bao gồm làm nông và chúng có khả năng trả lời bảng câu hỏi nghiên cứu một cách thích hợp.Dựa trên một nghiên cứu được thực hiện với những người tham gia sống tại Quận Nong vào năm 2017 cho thấy tỷ lệ nhiễm KSTSR không triệu chứng là 4,8% ở thời điểm ban đầu và dựa trên sự giảm số ca mắc bệnh sốt rét hiện nay, họ đã đưa ra giả thuyết rằng bằng cách sử dụng phương pháp phân tử (LAMP) sẽ có 2% trường hợp nhiễm KSTSR không triệu chứng. Sử dụng phần mềm Easy R (EZR) (phiên bản 1.61, TTYT Saitama, Đại học Y khoa Jichi, Nhật Bản) với các chi tiết giả định sau đây để tính toán cỡ mẫu: Tỷ lệ: 2%; Mức độ tin cậy: 95%; Độ rộng khoảng tin cậy: 1,5%, cỡ mẫu tối thiểu cần thiết là 1339. Tuy nhiên, cỡ mẫu được Ủy ban Đạo đức Quốc gia về Nghiên cứu Y tế của Lào phê duyệt là 725. Điều này là do những hạn chế thực tế, chủ yếu là hạn chế về nguồn lực và sự sẵn có của người tham gia tại các làng mục tiêu trong quá trình thu thập dữ liệu. Do đó, độ rộng khoảng tin cậy được điều chỉnh thành 2% với cùng giả định về tỷ lệ người mang Plasmodium không triệu chứng (2%) và khoảng tin cậy (95%). Kết quả là, kích thước mẫu tối thiểu cần thiết là 753.
Hình 4. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt vòng lặp (LAMP) phát hiện sốt rét Pan-LAMP xác định chính xác mẫu dương tính với sốt rét, sau đó xác nhận P. vivax (ống 1) và P. knowlesi (ống 6).
Nguồn:www.researchgate.net/publication/329335151_Laboratory_challenges_of_
Plasmodium_species_identification_in_Aceh_Province_Indonesia_a_malaria_elimination_setting_
with_newly_discovered_P_knowlesi/
Nhóm nghiên cứu gồm 06 cán bộ y tế địa phương và 02 nhân viên từ Viện Pasteur Lào, những người đã được đào tạo trước khi cuộc khảo sát bắt đầu, cùng một nhóm 03 người từ Đại học Ryukyus, Nhật Bản. Bản câu hỏi khảo sát được dịch từ tiếng Anh sang tiếng Lào bởi một người bản ngữ và được một CBYT địa phương khác kiểm tra lại độc lập. Sau đó, bản câu hỏi này được biên soạn bằng phần mềm Epicollect5 và nhập vào máy tính bảng được sử dụng để phỏng vấn người tham gia.Trước khi bắt đầu, danh sách hộ gia đình trong các làng được lập ra với sự trợ giúp của nhân viên TTYT địa phương bằng cách ghi lại thông tin cư dân trong mỗi hộ gia đình tại các làng mục tiêu. Trước khi khảo sát, trưởng thôn và các tình nguyện viên YTTB đã tiến hành tuyên truyền về nghiên cứu để huy động người tham gia. Trước khi khảo sát, một cuộc thử nghiệm sơ bộ đã được thực hiện với 28 người tham gia tình nguyện tại một làng không phải là làng mục tiêu để điều chỉnh bảng câu hỏi. Trong quá trình khảo sát, người tham gia được mời đến nhà trưởng thôn theo nhóm gia đình, nơi sử dụng danh sách hộ gia đình để đăng ký người tham gia. Nghiên cứu đã được giải thích và sự đồng ý bằng văn bản có hiểu biết đã được thu thập từ những người tham gia sẵn lòng tham gia khảo sát.Mỗi người tham gia được cấp một mã số định danh duy nhất gồm 5 chữ số. Thông tin về nhân khẩu học, tiền sử bệnh lý và các biện pháp phòng ngừa sốt rét đã được thu thập, và nhiệt độ màng nhĩ được đo. Các tình nguyện viên y tế thôn bản đã hỗ trợ phiên dịch các câu hỏi khảo sát cho những người tham gia không nói được tiếng Lào.
Sau đó, khoảng 250 µl mẫu máu lấy từ đầu ngón tay được thu thập: 50 µl được sử dụng để làm tiêu bản máu dày và mỏng, và 200 µl được làm khô trên giấy lọc (Whatman™ FTA® Classic Card, GE Healthcare Life Sciences, Anh) để thực hiện xét nghiệm LAMP. Mỗi tiêu bản máu và giấy lọc được đánh dấu bằng mã số định danh duy nhất của người tham gia. Giấy lọc có vết máu khô được đóng gói trong túi kín có chứa chất hút ẩm, còn các tiêu bản máu dày và mỏng được đóng gói trong hộp đựng lam kính có nhãn. Tất cả các mẫu được vận chuyển đến BV Quận Nông, nơi chúng được bảo quản ở nhiệt độ phòng, và sau đó được chuyển đến Viện Pasteur Lào vào ngày hôm sau.
Các tiêu bản máu được chuẩn bị như một tiêu chuẩn vàng để định lượng mật độ ký sinh trùng và xác định loài. Việc nhuộm tiêu bản máu được thực hiện tại Bệnh viện huyện Nông. Sau khi cố định tiêu bản mỏng bằng methanol, cả hai tiêu bản (mỏng và dày) đều được nhuộm bằng dung dịch Giemsa 10%. Các tiêu bản máu dày được kiểm tra dưới kính hiển vi quang học với dầu nhúng (độ phóng đại 100×) một cách độc lập bởi hai nhà soi kính hiển vi giàu kinh nghiệm (một kỹ thuật viên phòng thí nghiệm y tế và một nhà nghiên cứu soi KHV từ Viện Pasteur Lào). Hai trăm trường quan sát ở độ phóng đại cao đã được kiểm tra trước khi báo cáo kết quả âm tính. Bất kỳ sự không nhất quán nào, chẳng hạn như kết quả dương tính từ một nhà soi kính hiển vi và kết quả âm tính từ một xét nghiệm viên soi KHV khác, đều được giải quyết bởi một XNV giàu kinh nghiệm thứ ba.
(còn nữa) --> Tiếp theo Phần 2