Chiết tách DNA bằng phương pháp siêu nhanh (chiết tách DNA LAMP PURE)
Axit deoxyribonucleic (DNA) được chiết xuất từ các mẫu máu khô trên giấy lọc bằng bộ kit chiết xuất DNA Loopamp ™ PURE (Eiken Chemical Co., Ltd., Nhật Bản) theo hướng dẫn của nhà sản xuất tại Viện Pasteur Lào. Tóm lại, một mẩu máu khô đường kính 6 mm được đục trực tiếp vào ống gia nhiệt và thêm 30 μl dung dịch NaCl 334 mM. Sau khi trộn đều, ống được đặt vào khối gia nhiệt của máy Loopamp LF-160 (75 °C trong 5 phút). Sau khi lấy ra và làm nguội trong 2 phút, ống gia nhiệt được vặn vào ống hấp thụ, lắc nhẹ và xoay 20 lần để trộn dung dịch chiết xuất với bột hấp thụ. Bột hấp thụ xốp loại bỏ protein và các chất gây ô nhiễm khác khỏi dung dịch chiết xuất có thể ức chế quá trình khuếch đại axit nucleic. Sau đó, DNA đã chiết xuất được chuyển ngay lập tức vào ống phản ứng LAMP.
Khuếch đại DNA bằng phương pháp LAMP
Xét nghiệm Pan LAMP phát hiện tất cả các loài Plasmodium gây bệnh ở người ( Bộ dụng cụ phát hiện Malaria Pan Loopamp™, Công ty TNHH Hóa chất Eiken, Nhật Bản) (mồi đặc hiệu cho chi Malaria Pan: độ nhạy 97,0%; độ đặc hiệu 99,2%) được sử dụng để khuếch đại DNA Plasmodium. Việc khuếch đại DNA bằng phương pháp LAMP được thực hiện ở nhiệt độ không đổi (điều kiện đẳng nhiệt) bằng cách sử dụng một enzyme và 04 mồi nhận biết 6 vùng khác nhau trên mục tiêu. Các mồi đặc hiệu cho Malaria-Pan được thiết kế để phát hiện DNA ty thể với trình tự cơ sở được bảo tồn tốt (RNA ribosome 18S) trong bốn loài Plasmodium spp. gây bệnh sốt rét phổ biến nhất (P. falciparum, P. vivax, P. ovale và P. malariae). Do đó, khi có DNA Plasmodium spp., một trong các mồi sẽ liên kết với DNA bổ sung hoặc phù hợp từ ký sinh trùng.
Trước khi phản ứng bắt đầu, 30 μl DNA đã chiết xuất được cho vào ống phản ứng LAMP, có nắp chứa dạng khô enzyme DNA polymerase dịch chuyển chuỗi, deoxynucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP và dTTP), magie clorua, dung dịch đệm phản ứng và mồi đặc hiệu cho Malaria Pan. Thuốc thử LAMP khô này [thuốc thử phát hiện Malaria Pan (dMAL Pan)] được hòa tan bằng cách lật ngược và lắc ống phản ứng. Sau đó, ống phản ứng được ủ ở 65°C trong 40 phút và ở 80°C trong 5 phút (vô hiệu hóa enzyme) bằng thiết bị giữ nhiệt Loopamp LF-160 với đèn cực tím (UV) (Loopamp LF-160-Eiken Chemical Co. Ltd., Nhật Bản). DNA được khuếch đại bởi enzyme DNA polymerase dịch chuyển chuỗi theo phản ứng LAMP. Mỗi lần chạy đều bao gồm các mẫu đối chứng âm tính và dương tính.
Phiên giải định loài cụ thể và tính hợp lệ của LAMP
Trong nghiên cứu này, nhiễm Plasmodium không triệu chứng được định nghĩa là phát hiện DNA của KSTSR ở những người tham gia không sốt với nhiệt độ < 37,5°C, không có các triệu chứng liên quan đến sốt rét như đau đầu, ớn lạnh, đau khớp, nôn mửa,… 2 tuần trước và tại thời điểm khảo sát.Việc phát hiện DNA khuếch đại được thực hiện bằng mắt thường dưới ánh sáng UV. Phản ứng được coi là dương tính khi có ánh sáng xanh huỳnh quang trong ống phản ứng và âm tính khi không có. Nếu bất kỳ mẫu đối chứng nào (dươngvà âm tính) không hợp lệ, tất cả phản ứng đều không hợp lệ và cần lặp lại. Các mẫu dương tính được kiểm tra lại bằng bộ dụng cụ phát hiện P.falciparum (Loopamp™ Malaria Pf Detection) &phát hiện P. vivax (Loopamp™ Malaria Pv Detection) để xác định loài.
Hình 5. Kết quả xét nghiệm LAMP thông thường sử dụng dịch chiết vi khuẩn, với các công cụ chẩn đoán Pantoea spp.
(I) và P. ananatis (II). Các ống huỳnh quang màu xanh lá cây là dương tính (+) trong khi các ống khác là âm tính
Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221501612100008X#!
Dữ liệu phỏng vấn được trích xuất bằng bảng tính từ máy chủ lưu trữ dữ liệu Epicollect 5. Việc làm sạch dữ liệu được thực hiện bằng cách loại bỏ các bản ghi trùng lặp, kiểm tra sự không nhất quán và chuẩn hóa tên biến cũng như định dạng. Trong số 628 người tham gia đã đăng ký, 4 người tham gia không được phỏng vấn và 2 người được phỏng vấn đã bị loại khỏi phân tích dữ liệu do không cung cấp mẫu máu.Các biến giải thích bao gồm giới tính, nhóm tuổi, nhiệt độ, nghề nghiệp, có triệu chứng sốt rét trong 2 tuần trước, có triệu chứng sốt rét trong quá trình khảo sát, có ở trong rừng trong tháng trước, làm việc ban đêm trong rừng và sử dụng các biện pháp bảo vệ; biến kết quả là tình trạng nhiễm sốt rét được xác định bằng phương pháp LAMP. Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm EZR. Các biến liên tục (tuổi và nhiệt độ) được tóm tắt thành giá trị trung vị (khoảng tứ phân vị). Kiểm định Mann-Whitney U được thực hiện để so sánh giá trị trung vị của các nhóm tuổi và nhóm nhiệt độ khác nhau. Đối với các biến phân loại, kiểm định chính xác Fisher được thực hiện để xác định mối liên hệ thống kê giữa các biến giải thích và biến kết quả (tình trạng nhiễm KSTSR được xác định bằng LAMP), giá trị p<0,05 được chấp nhận là mối liên quan có ý nghĩa.
Trong nghiên cứu này, có 622 người tham giađến từ 164 hộ gia đình. Trong ba làng, Asing Na có số lượng người tham gia cao nhất, chiếm 44,0% (274/622), tiếp theo là Laou, 40,2% (250/622), và Paliangkao, 15,8% (98/622). Nữ chiếm đa số (58,4%) trong tổng số người tham gia. Độ tuổi của nhóm nghiên cứu dao động từ 2-89 tuổi với tuổi trung vị là 16 tuổi (IQR: 9-33). Nhóm người tham gia chiếm đa số từ 15 tuổi trở lên ( 53,8%), có 9 người tham gia bị sốt tại thời điểm khảo sát (nhiệt độ cơ thể > 37,5ºC); nhiệt độ cơ thể của 4 người tham gia bị thiếu.
Trong số người tham gia, 350 cuộc phỏng vấn đã được tiến hành (hai cuộc phỏng vấn bị loại khỏi phân tích vì không cung cấp mẫu máu) với những người tham gia từ 13 tuổi trở lên. Hầu hết những người được phỏng vấn không có trình độ học vấn chính thức (69,2%) và là nông dân (96,6%).Quan sát các tiêu bản máu dày dưới KHV không phát hiện trường hợp nào dương tính với KSTSR trong nghiên cứu. Quan sát các tiêu bản máu mỏng của các mẫu dương tính với xét nghiệm LAMP dưới KHV quang học cũng không phát hiện trường hợp nào dương tính.
Xét nghiệm LAMP trên tổng số 622 mẫu máu cho thấy 13 ca nhiễm Plasmodium spp., chủ yếu tập trung ở người lớn (tuổi trung bình: 43, IQR: 16-48; p < 0,05). P. vivax chiếm 15,4% (2/13). Các loài còn lại không thể xác định được. Nhìn chung, tỷ lệ nhiễm Plasmodium spp. không triệu chứng là 1,8% (11/622; CI95% 0,9-3%). Trong tổng số 13 trường hợp sốt rét, làng Laou có tỷ lệ nhiễm cao nhất, 3,6% (9/250), tiếp theo là Asing Na, 1,5% (4/274). Không phát hiện trường hợp nhiễm sốt rét nào trong số những người tham gia từ làng Paliangkao (0/98). Hai trẻ em trong độ tuổi đi học (6 và 8 tuổi) có kết quả xét nghiệm dương tính với sốt rét nhưng không sốt; Nam chiếm 53,8% số ca nhiễm sốt rét; Nhiệt độ cơ thể của một trường hợp dương tính với sốt rét (1/13, người lớn, nam) không được ghi nhận và do đó được phân loại là không có triệu chứng cũng không phải không có triệu chứng; 92,3% (12/13) các trường hợp dương tính không bị sốt (nhiệt độ <37,5°C) tại thời điểm khảo sát. Chỉ có một người tham gia (người lớn) có triệu chứng (đau đầu và ớn lạnh) 2 tuần trước khảo sát, và đau đầu vào ngày khảo sát và xét nghiệm dương tính với sốt rét mà không sốt. Do đó, người này được loại trừ khỏi nhóm sốt rét không triệu chứng.
Trong tập dữ liệu này, không có mối liên hệ nào có ý nghĩa thống kê giữa các biến giải thích và các trường hợp nhiễm bệnh không triệu chứng. Tuy nhiên, 81,8% (9/11) các trường hợp nhiễm bệnh không triệu chứng được phát hiện ở những nông dân từ 15 tuổi trở lên. Ngoài ra, trong số các trường hợp dương tính với sốt rét, không có người cùng sống hoặc thành viên nào trong hộ gia đình được phát hiện mắc bệnh sốt rét. 90% số người tham gia (313/348) dùng màn chống muỗi khi ngủ ở làng, và 88,5% trong số họ cho biết luôn sử dụng màn. Một tháng trước cuộc khảo sát, 75,6% người tham gia đã đến rừng và họ chiếm 72,7% (8/11) các trường hợp mắc; 21,3% trong số họ làm việc ban đêm trong rừng. Trong số những người đi rừng, 23,6% cho biết không sử dụng màn chống muỗi trong rừng. Trong nghiên cứu này, những người tham gia không sử dụng màn chống muỗi đã đưa ra các lý do sau: “không có màn chống muỗi”, “không có màn chống muỗi dự phòng cho rừng”, “nóng trong màn”, “khó mang màn chống muỗi vào rừng” và “màn gây ngứa người”. Chỉ có một số ít người tham gia (38) trong số những người được phỏng vấn đã đi đến các huyện khác như Xepon, Xiengkhuang và Champhonne cũng như nước láng giềng Việt Nam.
Chương trình phát hiện ca bệnh chủ động dựa vào cộng đồng đầu tiên sử dụng kỹ thuật LAMP để chẩn đoán sốt rét đã đánh giá tỷ lệ nhiễm Plasmodium không triệu chứng tại ba ngôi làng hẻo lánh của Lào. Dù số ca mắc bệnh sốt rét đã giảm đáng kể ở huyện Nong trong 2 năm qua (2022-2023), phát hiện chính của nghiên cứu này là tỷ lệ nhiễm Plasmodium không triệu chứng 1,8% . Điều này cho thấy số người mang Plasmodium không triệu chứng vẫn còn đáng kể ở hai ngôi làng được nghiên cứu (Asing Na và Laou). Tỷ lệ nhiễm không triệu chứng củng cố các nghiên cứu trước đây được thực hiện trong các khu vực LHSR tương tự với tỷ lệ lây truyền thấp ở biên giới Tây Bắc Thái Lan, nơi có 2,3% trường hợp nhiễm trùng dưới KHV được báo cáo bằng cách dùng LAMP và ở miền đông Myanmar, nơi có 2,3% trường hợp nhiễm Plasmodium không triệu chứng được báo cáo.
Mặc dù chương trình TDA (phát hiện và kiểm soát dịch bệnh sốt rét) được chính phủ Lào thực hiện ở một số làng thuộc huyện Nong, nhưng chương trình này không được triển khai ở ba làng được nghiên cứu. Thêm vào đó, chỉ có 02 trường hợp mắc sốt rét được ghi nhận ở Laou vào năm 2022 và không có trường hợp sốt rét nào được ghi nhận bởi các CSYT địa phương hoặc tình nguyện viên YTTB từ năm 2023-2024 (thời điểm khảo sát này). Tuy nhiên, Laou là làng có tỷ lệ nhiễm cao nhất (3,6%; 9/250) trong nghiên cứu này. Điều này cho thấy các CSYT áp dụng phương pháp phát hiện thụ động đã bỏ sót các ca nhiễm KSTSR, dẫn đến sự lây lan của bệnh. Điều này phù hợp với tình hình ở tỉnh Khammouane, nơi xảy ra dịch sốt rét (116 trường hợp) ở huyện Nakay vào tháng 6-7 năm 2023, trong khi chỉ có một trường hợp sốt rét được báo cáo từ tháng 1 năm 2022 đến tháng 6 năm 2023 [nguồn CMPE, Lào].
Những kết quả này cho thấy Plasmodium đang lưu hành trong một số khu vực và quần thể cụ thể tạo thành ổ chứa KSTSR và có thể góp phần vào sự lây lan của nó. Vì những cá nhân này không nhận thức được tình trạng nhiễm Plasmodium của họ do không có triệu chứng, nên họ không tìm kiếm điều trị từ các CSYT hoặc YTTB. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây ở Tiểu vùng sông Mê Kông mở rộng. Do đó, việc nhắm mục tiêu vào những cá nhân có nguy cơ để sàng lọc bằng phương pháp LAMP và điều trị 6 tháng hoặc 1 năm một lần (tùy thuộc vào nguồn lực sẵn có) sẽ là một cách tiếp cận thiết yếu để duy trì số ca mắc sốt rét bằng không nhằm ngăn chặn sự lây lan tiềm tàng của bệnh và đạt được mục tiêu LTSR.
Đã ghi nhận sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ nhiễm Plasmodium giữa 3 làng, dù Asing Na là ngôi làng có nhiều người tham gia nghiên cứu nhất, chiếm 44,1% (274/622), nhưng chỉ có 1,5% (4/274) trường hợp mắc sốt rét được phát hiện. Mặt khác, Laou là ngôi làng có nhiều trường hợp nhiễm nhất [3,6% (9/250)], trong khi không phát hiện Plasmodium nào trong số những người tham gia ở làng Paliangkao. Những khác biệt này có thể được giải thích bởi các yếu tố môi trường như khoảng cách của các làng đến rừng và việc con người tiếp xúc với muỗi Anopheles do nghề nghiệp (làm việc trong rừng). Điều này có thể giải thích tỷ lệ nhiễm không triệu chứng cao ở làng Laou, vì 48% người tham gia đã đến rừng một tháng trước nghiên cứu này, so với 39,5% và 12,5% ở Asing Na và Paliangkao tương ứng. Sự không đồng nhất này phù hợp với các nghiên cứu trước đây ở Savannakhet -Tây Bắc Thái Lanvà ở phía Tây Campuchia.
Sự tập trung của hơn 80% các ca nhiễm Plasmodium không triệu chứng ở những nông dân trẻ và trưởng thành (≥ 15 tuổi) có thể được giải thích bởi thực tế là thanh thiếu niên lớn tuổi và những người ở độ tuổi trung niên có khả năng bị nhiễm do nghề nghiệp, chẳng hạn như làm việc trong rừng hoặc ruộng. Do đó, họ có thể đã phát triển khả năng miễn dịch với bệnh sốt rét sau khi tiếp xúc thường xuyên với Plasmodium, điều này khiến họ dễ bị nhiễm Plasmodium không triệu chứng. Xu hướng này phù hợp với nghiên cứu ở biên giới Tây Bắc Thái Lan, báo cáo rằng nguy cơ nhiễm Plasmodium spp. không triệu chứng cao nhất nằm trong độ tuổi từ 31-45. Nghiên cứu ở miền Đông Myanmar cũng báo cáo nhiễm Plasmodium không triệu chứng chỉ giới hạn ở người > 17 tuổi.
Nhiễm KSTSR được phát hiện ở 13 hộ gia đình khác nhau. Tuy nhiên, không có thành viên nào trong gia đình hoặc người cùng sống với người bị nhiễm bệnh được phát hiện dương tính. Điều này có thể được giải thích bởi thực tế là việc lây truyền sốt rét thường xảy ra bên ngoài hộ gia đình ở Tiểu vùng sông Mê Kông mở rộng. Điều này cho thấy trẻ nhỏ sẽ ít tiếp xúc với các vectơ sốt rét hơn nếu chúng không đến rừng hoặc trang trại. Ngoài ra, 90% người tham gia báo cáo sử dụng màn chống muỗi khi ở trong làng. Mặc dù về mặt thống kê, không có mối liên hệ đáng kể giữa nghề nghiệp và nhiễm trùng không triệu chứng trong nghiên cứu này, tất cả các trường hợp nhiễm không triệu chứng đều được tìm thấy ở những người nông dân từ 15 tuổi trở lên, ngoại trừ 02 trẻ em trong độ tuổi đi học (6 và 8 tuổi). Hơn nữa, 75,6% người tham gia được phỏng vấn đã đến rừng một tháng trước cuộc khảo sát, điều này cũng có thể khiến họ tiếp xúc với nhiễm. Thực tế là cuộc khảo sát được tiến hành trong mùa khô khi số lượng muỗi Anopheles trong làng thấp, có thể là một lý do khác khiến không quan sát thấy sự lây truyền trong nội bộ hộ gia đình.Ngoài ra, việc thiếu sử dụng các biện pháp phòng ngừa trong các nhóm dân cư có nguy cơ cao là khá đáng kể, điều này gây lo ngại trong bối cảnh gần như LTSR. Để đảm bảo phá vỡ chuỗi lây truyền dù tỷ lệ thấp, việc tăng cường sử dụng các biện pháp phòng ngừa sốt rét là rất cần thiết.
Trong số 13 ca nhiễm Plasmodium spp. dương tính, chỉ có 02 ca là P. vivax. Các loài còn lại không thể xác định được, điều này có thể được giải thích bởi thực tế là mặc dù xét nghiệm Pan LAMP có độ nhạy cao, nhưng nó chỉ có thể phát hiện DNA của giống Plasmodium mà không xác định được loài và do đó, cần các xét nghiệm đặc hiệu loài để xác định thêm. Do đó, trong nghiên cứu này, họ đã dùng hai bộ LAMP đặc hiệu loài (bộ phát hiện P. falciparum và bộ phát hiện P. vivax) để xác định loài của các mẫu dương tính, vì trong khu vực nghiên cứu, chỉ có hai loài Plasmodium này phổ biến. Việc không xác định được P. falciparum hoặc nhiều trường hợp P. vivax hơn có thể là do mật độ KSTSR thấp trong các mẫu máu mao mạch chích ngón tay, điều này có thể khiến DNA mục tiêu của một loài cụ thể không đủ để khuếch đại xét nghiệm đặc hiệu loài. Việc không xác định được loài Plasmodium này cũng đã được báo cáo trong các nghiên cứu khác đã sử dụng các phương pháp phân tử khác như PCR. Ngoài ra, các loài chưa được xác định cũng có thể là các loài Plasmodium khác ngoài P. falciparum và P. vivax. Cần có thêm các nghiên cứu để làm rõ khả năng này.
Hình 6. Quan sát huỳnh quang bằng cách thêm trước gel Green vào hỗn hợp phản ứng.
Kết quả trình bày cho các độ pha loãng của P. vivax - Một thí nghiệm tiêu biểu được hiển thị (DBS viết tắt của mẫu máu khô)
Nguồn: https://link.springer.com/article/10.1186/s12936-019-2979-4
Nghiên cứu hiện tại có một số hạn chế như kích cỡ mẫu nhỏ có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của các ước tính. Ngoài ra, nghiên cứu được tiến hành trong mùa khô, là thời kỳ mà tỷ lệ lây truyền sốt rét thấp ở Lào. Một hạn chế khác là các cuộc phỏng vấn được thực hiện với những người tham gia từ 13 tuổi trở lên và nghiên cứu chỉ giới hạn ở 3 làng trong huyện. Phạm vi địa lý thấp này có thể ảnh hưởng đến khả năng khái quát hóa nghiên cứu. Hơn nữa, phân tích đa biến không được thực hiện do tỷ lệ nhiễm trùng không triệu chứng thấp, khiến việc phân tích không phù hợp. Sự hiện diện ít của các ca nhiễm trùng trong các biến kết quả có thể dẫn đến sức mạnh thống kê không đủ.
Nghiên cứu hiện tại cho thấy tỷ lệ nhiễm Plasmodium không triệu chứng là 1,8% (11/622) ở các vùng nông thôn lưu hành bệnh tại Lào. Phần lớn các ca nhiễm không triệu chứng tập trung ở thanh thiếu niên lớn tuổi và nông dân trưởng thành, trong đó một tỷ lệ đáng kể những người thuộc nhóm nguy cơ này không sử dụng các biện pháp bảo vệ.Những phát hiện này cho thấy các ổ chứa mầm bệnh rất đáng chú ý do thiếu các biện pháp phòng ngừa, điều này có thể đe dọa nỗ lực kiểm soát và LTSR. Do đó, việc LTSR ở Lào vào năm 2030 cần có các biện pháp can thiệp nhắm vào nhóm dân số trưởng thành có nguy cơ cao để sàng lọc bằng các công cụ nhạy bén, kết hợp với việc nâng cao nhận thức về các biện pháp phòng ngừa và nhiễm Plasmodium không triệu chứng .
Nghiên cứu thí điểm tại Zanbiar
Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt dựa trên vòng lặp (LAMP) để phát hiện nhanh chóng người mang ký sinh trùng sốt rét mật độ thấp không triệu chứng ở Zanzibar do nhóm Jackie Cook và cộng sự tiến hành (2015), việc phát hiện các trường hợp nhiễm sốt rét không triệu chứng, với mật độ ký sinh trùng sốt rét thấp, rất khó khăn với các phương pháp chẩn đoán tại chỗ hiện có. Nghiên cứu này đã thử nghiệm bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt dựa trên vòng lặp (LAMP) để phát hiện nhanh chóng các trường hợp nhiễm KSTSR không triệu chứng tại thực địa trong quá trình sàng lọc và điều trị hàng loạt (MSAT) ở Zanzibar, một khu vực đang trong giai đoạn chuẩn bị LTSR.
Việc sàng lọc đã được tiến hành tại ba khu vực được biết đến là điểm nóng trước mùa mưa ngắn vào tháng 11. Mẫu máu lấy từ đầu ngón tay được dùng để sàng lọc bằng xét nghiệm chẩn đoán nhanh (RDT) và LAMP, sau đó được thu thập trên giấy lọc để phân tích bằng phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR). Kết quả LAMP được so sánh với RDT và PCR bằng phép thử McNemar. Khoảng 1.000 người đã được sàng lọc, trong đó xét nghiệm nhanh (RDT) phát hiện 10 ca nhiễm (1% (khoảng tin cậy 95% 0,3-1,6) trong khi cả xét nghiệm LAMP và PCR đều phát hiện 18 ca nhiễm (1,8% (khoảng tin cậy 95% 0,9-2,6)). Tuy nhiên, xét nghiệm PCR xác định được 3 ca nhiễm bệnh mà xét nghiệm LAMP không phát hiện và ngược lại. Xét nghiệm LAMP dễ dàng mở rộng quy mô trong điều kiện thực địa, chỉ cần đào tạo và thiết bị tối thiểu, với kết quả có sẵn từ một đến ba giờ sau khi sàng lọc.Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh thấp hơn dự kiến, xét nghiệm LAMP đã phát hiện số ca nhiễm cao hơn so với xét nghiệm chẩn đoán nhanhhiện đang sử dụng. LAMP là một xét nghiệm chẩn đoán nhạy, dễ thực hiện tại thực địa, có thể hữu ích cho các chiến dịch PCSR bằng phương pháp (MSAT) vốn yêu cầu kết quả nhanh chóng để có thể điều trị kịp thời.
(còn nữa) --> Tiếp theo Phần 3
TS.BS. Huỳnh Hồng Quang & CN. Nguyễn Thái Hoàng
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn