Sắc ký lỏng cao áp (HPLC-High Press Liqiud Concetration) là một nhóm các phương pháp hóa lý để tách thành phần của một hỗn hợp dựa trên sự phân chia của các chất vào hai pha luôn tiếp xúc nhau và không trộn lẫn nhau: 1 pha tĩnh (SP) và 1 pha động (MP). Các chất trong hỗn hợp được tách bởi sự khác nhau về đặc tính vật lý và hóa lý của chúng. Sự khác nhau này quyết định tốc độ di chuyển các tiểu phân trong hỗn hợp dưới tác động của pha động chạy qua pha tĩnh. Như vậy quá trình sắc ký phải trải qua các giai đoạn đưa mẫu lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh và phát hiện các chất. Trên nguyên lý kỹ thuật như vậy, sắc ký lỏng cao áp có thể ứng dụng trong định tính và định lượng thuốc, phân tích kiểm nghiệm các thành phần hóa chất trong thực phẩm và môi trường đạt chất lượng cao, đáp ứng đầy đủ các quy định quốc gia và quốc tế (đạm, béo bột, đường, xơ; vitamin, thành phần aminoaxit; phụ gia thực phẩm, chất hoạt động bề mặt; khoáng, nguyên tố vi lượng, kim loại nặng (Hg, As, Cd¸ Pb…); độc tố nấm mốc (aflatoxin, ochratoxin); dư lượng thuốc trừ sâu, diệt cỏ; dư lượng kháng sinh (chloramphenicol, nitrofuran, fluoroquinolone, họ tetracycline, sulfamide…); dư lượng hocmon kích thích tăng trưởng đã bị cấm (clenbuterol, salbutamol…); dư lượng malachite green, leucomalachite green; màu bị cấm trong thực phẩm (các loại Soudan) và vi sinh có hại…
Nhằm giúp cho các đơn vị phía Nam sử dụng và phát huy tốt các ứng dụng trong sắc ký lỏng cao áp, ngày 24/4/2007 tại Khách sạn Sofitel-TP. Hồ Chí Minh; Công ty Merck KgaA (Đức) đã tổ chức Hội thảo “Khắc phục-phòng tránh các sự cố thường gặp và chuẩn hóa trong phân tích HPLC” với sự trình bày của các chuyên gia TS. Rod Mcllwrick-Công ty Merck KGaA, Darmstadt (Đức), GS.TS. Chu Phạm Ngọc Sơn-Đại học, Hội Hóa học TP. Hồ Chí Minh, TS. Phạm Thị Ánh-Phó Giám đốc Trung tâm Đào tạo & Phát triển sắc ký TP. Hồ Chí Minh. Nội dung các báo cáo tập trung vào các vấn đề thường gặp trong phân tích bằng HPLC, pha động-chọn và sử dụng hiệu quả dung môi HPLC, chuẩn bị mẫu, sử dụng cột SPE cho phân tích phẩm màu Sudan trong trứng gia cầm, cột phân tích HPLC, 100 năm sắc ký đồng hành cùng Merck Chromolith-sáng tạo từ thực tiễn, khắc phục-phòng tránh sự cố thường gặp và chuẩn hóa trong phân tích HPLC, thiết bị HPLC và hướng giải quyết.
 |
TS.Darmstadt-Công ty Merck KGaA trình
bày “Khắc phục-phòng tránh các sự cố
thường gặp và chuẩn hóa trong
phân tích HPLC” |
Một số vấn đề thường gặp trong phân tích bằng HPLC:
Các vấn đề ở đây là hệ thống máy không thể kiểm tra và phát hiện được nên chúng ta phải tự kiểm tra và chẩn đoán để giải quyết vấn đề, tìm kiếm nguyên nhân của vấn đề và tối ưu hóa hệ thống để tránh được các vấn đề lặp lại như độ rửa rải (Rs), vấn đề cân bằng, Peak, sự rò rỉ và chảy, độ nhạy và độ chọn lọc, áp suất và hệ thống máy (có thể xảy ra trong một modum trong hệ thống máy). Để đánh giá đúng phương pháp, chúng ta cần chú ý đến các yếu tố sau: pha động, độ pH, cột, nhiệt độ, tốc độ dòng.
Pha động-chọn và sử dụng hiệu quả dung môi HPLC:
Chuẩn bị pha động: hóa chất và dung môi dùng trong pha động phải sạch và có độ tinh khiết nhất định để có thể áp dụng được đầu dò detecter, dung môi và đệm cần lọc thật kỹ (dưới lỗ lọc 0,45 mm) đuổi khí pha động; hạn chế dùng đệm, nếu có dùng thì dùng đệm acetate tốt hơn là đệm phosphate. Nếu sử dụng dung môi là nước thì cần phải cẩn thận vì trong môi trường nước vi khuẩn có thể sinh sản và cần thường xuyên thay nước (phòng tránh các hạt gây ra hỏng máy hay tắc đầu cột), có thể dùng sodium azid 0,04 làm chất diệt khuẩn trong nước.
Dung môi của Merck có những ưu điểm sau: khi sử dụng không cần phải lọc, không dùng chất ổn định trong dung môi (vì chất ổn định thường tạo tạp), không chứa clo trong dung môi (vì nếu có clo dưới tác dụng của ánh sáng sẽ xảy ra phản ứng làm hỏng cột). Nếu sử dụng dung môi có chất lượng thấp khi chạy máy sẽ xuất hiện những peak lạ và có thể làm nghẹt cột hoặc hỏng máy, vì vậy đối với pha động phải sử dụng dung môi thật sạch và có độ tinh khiết cao.
 |
Cán bộ kỷ thuật thực hiện thao tác trên máy
sắc ký lỏng cao áp |
Chuẩn bị mẫu:
Tối thiểu-lọc mẫu:
-Nylon-bản chất ưu nước, làm việc với các mẫu tan trong nước và dung môi hữu cơ, có thể hấp khử trùng tới 1210C, khoảng pH = 3-12, không dùng với a xít đậm đặc.
-PTFE-màng kỵ nước, chịu tốt với các loại dung môi, axit, bazơ, loại màng này thường dùng cho các mẫu không chứa nước khoảng pH = 1-14.
-PVDF-chịu đựng tốt với hầu hết các loại dung môi, gắn kết thấp với protein, khoảng pH = 2-12.
-Chiết pha rắn-solid phase extraction (SPE)
-Chiết lỏng lỏng-liqiud liqiud extraction (LLE).
Chuẩn bị mẫu: hòa tan mẫu vào dung môi của pha động hay dung môi yếu hơn pha động (néu hòa tan mẫu trong dung môi mạnh hơn pha động sẽ làm dãn peak rộng chân), thể tích mẫu nên giữ nhỏ thì tốt hơn.
Cột phân tích:
Chọn cột: kiểu dáng, vật liệu làm cột, cách ghép nối; chủng loại và pha tĩnh; đường kính, chiều dài cột; kích cỡ hạt nhồi và kích cỡ lỗ xốp.
Cột tiêu chuẩn: thép không rỉ
Cột và bảo vệ cột:
Hạt nhồi cột gồm: hình cầu, dạng không đồng đều, dạng đá nguyên khối
Các vấn đề khi dùng cột: pH ổn định của cột từ 2-7,5; pha động phải lọc và khử khí hơi độc; nhồi cột bằng dung dịch acetonitril (tốt hơn các dung dịch khác) sau khi dùng đệm. Một số cột không chịu được pha động 100% là nước, vì vậy pha động cần có 1% hữu cơ là tốt hơn. Tốc độ dòng phải tăng từ từ, không được tăng đột ngột trong quá trình chạy máy sẽ không làm ảnh hưởng đến cột.
Thiết bị HPLC và hướng giải quyết: thiết bị tiêm mẫu đưa chính xác một lượng mẫu vào pha động (tiêm tự động), buồng cột và điều cần thiết của một Detecter là độ nhậy, độ chọn lọc, thông tin định tính, độ tuýen tính, độ ổn định.
Ứng dụng của HPLC: được ứng dụng trong phân tích kiểm nghiệm các lĩnh vực hóa học (thuốc nhuộm, phthalates…), sinh học (protein, peptides…), môi trường (các i on vô cơ, hydrocacbon thơm đa nhân…), hàng tiêu dùng (lipids, chống oxy hóa, sugar…), dược phẩm (tetracycline), y học lâm sàng (amino acide, vitamine…).
So sánh giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký khí (GC):
Dữ kiện | Sắc ký lỏng (HPLC) | Sắc ký khí (GC) |
Độ bay hơi | Không yêu cầu bay hơi, mẫu phải tan được trong pha động | Mẫu phải bay hơi được |
Độ phân cực | Tách được cả hai loại hợp chất phân cực và không phân cực | Mẫu phân cực và không phân cực |
Độ bền nhiệt | Phép phân tích được thực hiện tại nhiệt độ thấp (nhiệt độ phòng hay thấp hơn) | Mẫu buộc phải tồn tại ở nhiệt độ cao (nhiệt độ tách của cột và buồng tiêm mẫu) |
Khối lượng phân tử | Không có giới hạn trên về mặt lý thuyết, trên thực tế độ hòa tan là giới hạn. | Đặc trưng < 500 amu |
Chuẩn bị mẫu | Mẫu buộc phải lọc, mẫu nên có nội dung như pha động | Dung môi phải bay hơi và có nhiệt độ sôi thấp hơn các chất phân tích |
Lượng mẫu | Lượng mẫu phụ thuộc vào đường kính trong của cột | Thường từ 1-5ml |
Cơ chế tách | Thực hiện ở cả hai pha động và tĩnh | Chỉ có pha động là mang mẫu |
Detecter (đầu dò) | Thông dụng nhất là UV-VIS | Thông dụng là FID, dùng cho phân tích các chất hữu cơ |
Hội thảo cũng được nghe báo cáo minh họa của phương pháp HPLC, sử dụng cột SPE cho phân tích phẩm màu Sudan trong trứng gia cầm góp phần xác định các chất có độc trong vệ sinh an toàn thực phẩm.