|
Ý nghĩa nuôi cấy liên tục ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum trong nghiên cứu sốt rét kháng thuốc
Nuôi cấy liên tục ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) Plasmodium falciparum (P. falciparum) là một phương pháp tạo điều kiện cho KSTSR phát triển ở ngoài môi trường của cơ thể người. Hiện tại, KSTSR P.falciparum là loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) ở người có thể nuôi cấy dài ngày thành công nhất ở ngoài cơ thể. Mặc dù những cố gắng nhân chủng KSTSR loài P. falciparum ở bên ngoài cơ thể người hoặc động vật đã được thực hiện từ năm 1912 do tác giả Bass và cộng sự tiến hành, nhưng thành công của những nỗ lực bước đầu bị giới hạn trong một hoặc chỉ vài chu kỳ của KST ở giai đoạn hồng cầu. Vào năm 1976, nuôi cấy KSTSR P. falciparum dài ngày thành công đầu tiên được thực hiện. Những hy vọng ban đầu, việc thành công nuôi cấy KSTSR P. falciparum ngoài cơ thể sẽ tìm ra vaccine phòng chống bệnh sốt rét sớm hơn mong đợi. Bên cạnh, việc thành công nuôi cấy KSTSR P. falciparum đã giúp sự phát triển những thuốc chống sốt rét mới được thuận lợi nhiều. Phương pháp nuôi cấy KSTSR P.f dài ngày trong bình nến (candlejar) Hồng cầu bị nhiễm KSTSR P. falciparum được nuôi trong đĩa Petri hoặc trong bình plastic, có môi trường dinh dưỡng và huyết tương, huyết thanh hoặc huyết thanh thay thế, đặt trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C. Điểm đặc biệt của tủ ấm là có hỗn hợp khí mà chủ yếu là ni-tơ (93% nitrogen, 4% carbon dioxide (CO2), 3%oxygen) cho phép KST phát triển ở 370Ctrong tủ nuôi cấy tế bào. Một sự thay thế khí trong nuôi cấy để hỗn hợp khí có thành phần chính xác là dùng bình nến (nến và bình hút ẩm). Bình nến (candlejar) là bình kín hơi, khi nuôi cấy, nến thắp sáng được đặt trong bình. Nến trong bình cháy sẽ đốt một lượng oxygen và giải phóng ra khí carbon dioxide, như một bình cứu hỏa. Khí carbon dioxide trong không khí của bình dao động trong khoảng 0,036 - 0,039% trong ứng dụng này. Khi nồng độ khí carbon dioxide đạt 5% trong bình và nến sẽ tắt. Số lượng KST sẽ tăng lên xấp xỉ 5 lần trong mỗi 48 giờ (tương đương một chu kỳ của P.falciparum ở giai đoạn hồng cầu trong cơ thể người). Xác định mật độ KST thông qua việc làm tiêu bản và giữ mật độ KST trong giới hạn mong muốn bằng cách pha loãng hồng cầu bị nhiễm KST P.f alciparum với hồng cầu lành.
Phương pháp đầu tiên nuôi cấy nhân số lượng KSTSR P. falciparum lên ở ngoài cơ thể được đã mô tả là trong điều kiện tĩnh (phương pháp Trager Jensen). Vào năm 1976, James B.Jensen tham gia phòng thí nghiệm Trager, tư cách là một nghiên cứu sinh sau tiến sĩ. Ông đã quyết định dùng bình nến thay thế tủ ấm CO2. Mùa hè năm 1976, Milton Friedman, sinh viên tốt nghiệp ở phòng thí nghiệm Trager, đang làm việc ở những phòng thí nghiệm MRC (Medical Research Council) ở Gambia, đã chuẩn bị một mẫu máu người bị nhiễm KSTSR P. falciparum và được gửi đến New York. Sau đó, mẫu máu này được pha loãng với môi trường nuôi cấy RPMI (Roswell Park Memorial Institute) trong những đĩa petri, đặt trong bình nến và ủ ấm. Dòng KST này phát triển rất tốt, thuần chủng vàđược đặt tên là FCR-3/Gambia, là một trong những chủng KSTSR P .falciparum được sử dụng rộng rãi nhất. Sau đó, những dòng KSTSR P.falciparum khác cũng được tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy tương tự và ảnh hưởngcủa việc nuôi cấy dài ngày KSTSR P. falciparumlà hiện tượng đặc biệt trong việc thử thuốc chống sốt rét giả định và trong việc giải mã gen KSTSR P. falciparum. Một số thông báo sau đó (những năm đầu của thập niên 1980), cho thấy sự treo hồng cầu bị nhiễm KSTSR và hồng cầu lành trong môi trường nuôi cấy đã tăng số lượng KSTSR lên đáng kể. Sự khuấy liên tục của môi trường đã cải thiện các thông số khác tăng trưởng KSTSR có liên quan đến nghiên cứu, chẳng hạn kéo dài đồng bộ trong nuôi cấy sau khi thực hiện quy trình đồng bộ hóa thể KSTSR và tỷ lệ hồng cầu bị nhiễm KSTSR. Mặc dù vậy, thực hiện nuôi cấy KSTSR trong điều kiện tĩnh vẫn còn phổ biến.
Ý nghĩa lớn nhất của phương pháp bình nến là có thể sử dụng trong các phòng thí nghiệm bất cứ ở đâu, với điều kiện có một tủ ấm, nến và một bình hút ẩm (desiccator). Khoảng 60% hồng cầu bị ký sinh KSTSR có thể thu được nếu sử dụng điều kiện nuôi cấy tối ưu
 | | KSTSR P.f nuôi cấy dài ngày trên tiêu bản máu giọt đàn |
Tài liệu tham khảo1.Radfar A, Méndez D, Moneriz C, Linares M, Marín-García P, Puyet A, Diez A, Bautista JM (2009). "Synchronous culture of Plasmodium falciparum at high parasitemia levels". Nat Protoc 4 (11): 1828–1644. 2.Bass CC, Johns FM. (1912). "The Cultivation of Malarial Plasmodia (Plasmodium vivax and Plasmodium Falciparum) in vitro". J. Exp. Med. 16 (4): 567–579. 3.Trager W, Jensen JB (1976). "Human malaria parasites in continuous culture". Science 193 (4254): 673–675. 4.Trager W, Jensen JB (1997). "Continuous culture of Plasmodium falciparum: its impact on malaria research". Int J Parasitol 27 (9): 989–1006. 5.Basco LK (2003). "Molecular epidemiology of malaria in Cameroon. XV. Experimental studies on serum substitutes and supplements and alternative culture media for in vitro drug sensitivity assays using fresh isolates of Plasmodium falciparum". Am J Trop Med Hyg 69 (2): 168–173. PMID 14506772. 6.Trigg PI (1985). "Recent advances in malaria parasite cultivation and their application to studies on host-parasite relationships: a review". Bull World Health Organ 63 (2): 387–398. 7.Schuster FL (2002). "Cultivation of plasmodium spp". Clin Microbiol Rev 15 (3): 355–364. doi:10.1128/CMR.15.3.355-364.2002. PMC 118084. 8.Rüssmann L, Jung A, Heidrich HG (1982). "The use of percoll gradients, elutriator rotor elution, and mithramycin staining for the isolation and identification of intraerythrocytic stages of plasmodium berghei". Z Parasitenkd 66 (3): 273–280. 9.Allen RJW, Kirk K (2010). "Plasmodium falciparum culture: The benefits of shaking". Mol Biochem Parasitol 169 (1): 65–63. 10.Sherman IW (2010). "Magic Bullets to Conquer Malaria. From Quinine to Qinghaosu". Asm Press, ISBN 978-1-55581-543-1. 11.LeRoux M, Lakshmanan V, Daily JP (2009). "Plasmodium falciparum biology: analysis of in vitro versus in vivo growth conditions". Trends Parasitol 25 (10): 474–481. 12.Spadafora C, Gerena L, Kopydlowski KM (2011). "Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation". Malar J 10 (1): 96. 13.Coronado LM, Tayler NM, Correa R, Giovani RM, Spadafora C (2013). "Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means". J Vis Exp 73: e50342. 14.Rivadeneira EM, Wasserman M, Espinal CT (1983). "Separation and concentration of schizonts of Plasmodium falciparum by Percoll gradients". J Protozool 30 (2): 367–370. 15.Kim CC, Wilson EB, Derisi JL (2010). "Improved methods for magnetic purification of malaria parasites and haemozoin". Malar J 9 (1): 17. 16.Bhakdi SC, Ottinger A, Somsri S, Sratogno P, Pannadaporn P, Chimma P, Malasit P, Pattanapanyasat K, Neumann HP (2010). "Optimized high gradient magnetic separation for isolation of Plasmodium-infected red blood cells". Malar J 9 (1): 38. 17.Doolan, D. L. (2002), Malaria Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine) , Totowa, NJ: Humana Press, ISBN 0-89603-823-8 / ISBN 978-0-89603-823-3
|
TRANG CHỦ
