|
Một số điểm mới về kháng thuốc sốt rét dưới góc độ phân tử (Phần 2)
Artemisinin gây ra trạng thái ngủ ở P. falciparum và tái phát sốt rét _ Kháng thuốc? Sốt rét do nhiễm ký trùng Plasmodium spp. và lưu hành trên 106 quốc gia. Tỷ lệ mắc và tử vong do sự tăng trưởng và nhân lên nhanh chóng của ký sinh trùng Plasmodium trong hồng cầu của vật chủ. Điều trị sớm và hiệu quả rất quan trọng trong việc ngăn ngừa các biến chứng và tử vong, và là một yếu tố quan trọng trong chương trình kiểm soát và loại trừ bệnh sốt rét. Một vài thập kỷ trước đây, bệnh sốt rét có thể được điều trị hiệu quả bằng sử dụng một trong nhiều loại thuốc chống sốt rét bao gồm chloroquine, pyrimethamine/sulfadoxine (Fansidar), mefloquine và atovaquone/proguanil (Malarone). Hầu hết các thuốc tác động lên giai đoạn trưởng thành của ký sinh trùng trong hồng cầu và phòng chống ký sinh trùng nhân lên và trưởng thành. Vào cuối những năm 1960 P.falciparum phát triển đề kháng với chloroquine và sau đó phát triển đề kháng với hầu hết các thuốc khác nên các thuốc này không còn được sử dụng ở nhiều khu vực. Kháng thuốc sốt rét dẫn đến tăng gánh nặng bệnh tật, tăng lan truyền dịch bệnh. Như vậy, Plasmodium đề kháng với thuốc sốt rét đã trở thành một thách thức lớn trong cuộc chiến toàn cầu chống lại bệnh sốt rét. Năm 2001, TCYTTG khuyến cáo artemisinins dựa vào điều trị phối hợp ACTs là dòng sản phẩm đầu tiên dùng điều trị sốt rét P.falciparum chưa biến chứng và trong suốt thập kỷ qua các nước có bệnh sốt rét lưu hành đã chuyển hầu hết chính sách thuốc quốc gia sang ACTs. ART và các dẫn xuất của nó là thuốc chống sốt rét mạnh nhất và có tác dụng nhanh chóng. Thuốc tác động lên tất cả các giai đoạn sinh sản vô tính của KSTSR và có thể làm giảm số lượng ký sinh trùng lên đến 10.000 lần mỗi chu kỳ do đó làm giảm nhanh chóng các triệu chứng. Quan trọng hơn, đây là loại thuốc có tác dụng chống KSTSR đa kháng. ACTs cũng làm giảm sinh sản các giao bào và được báo cáo có tác động trên sự lây nhiễm. Vì những lý do này, ACTs đã trở thành nền tảng trong các chương trình kiểm soát và loại trừ bệnh sốt rét hiện nay. Mặc dù artemisinin có các hoạt tính vượt trội trên chủng ký sinh trùng P. falciparum, 3-50% bệnh nhân không có miễn dịch thất bại trong điều trị bằng artemisinins nếu nó được sử dụng đơn trị liệu. Các tỷ lệ thất bại do thời gian điều trị là chủ yếu, trường hợp có tỷ lệ thất bại cao hơn được quan sát thấy sau 3 ngày điều trị, giảm đi nếu kéo dài trong 5-7 ngày điều trị. Mật độ KSTSR cao trước khi điều trị (D0) cũng góp phần làm tăng tỷ lệ thất bại trong điều trị. Nguyên nhân được cho là các hợp chất artemisinins có thời gian bán hủy ngắn, không đủ để loại trừ tất cả các KSTSR trong quá trình điều trị, dẫn đến tái phát sớm (recrudescence). Tuy nhiên, tăng thời gian điều trị từ 3-5 ngày lên 5-7 ngày, chỉ giảm bớt nhưng không loại trừ tái phát một cách triệt để. Kết quả này rất khó để giải thích dựa trên dược lực học và dược động học/ tính năng hoạt động một mình của thuốc. Mặt khác, các KSTSR phân lập được từ những thất bại sau khi dùng artemisinin đơn trị liệu không kháng với artemisinin trên in vitro và tái điều trị là có hiệu quả. Tốc độ tái phát cao có thể giảm đáng kể bằng cách sử dụng artemisinin kết hợp với các thuốc chống sốt rét khác dạng đi kèm như mefloquin, lumefantrin, pyronaridin và piperaquin phosphate để tạo thành phối hợp ACTs. Cho đến nay, lý do về tỷ lệ tái phát cao khi dùng đơn trị liệu với artemisinins và cơ chế chính xác của artemisinin kết hợp làm giảm tái phát là không chắc chắn. Mối đe dọa chính đối với tính hiệu quả và thời gian lưu hành hữu ích của ACTs là sự phát triển của ký sinh trùng kháng với ART. Báo cáo gần đây ở Campuchia là ký sinh trùng giảm sự nhạy cảm in vivo với artesunate (AS), một dẫn xuất của ART, làm tăng mối lo ngại nghiêm trọng cho sự phát triển của kháng ART. Các dữ liệu lâm sàng từ phía tây Campuchia cho thấy thời gian làm sạch KST sau khi đơn trị liệu với AS được so sánh với các trường hợp ở tây bắc Thái Lan. Không có thay đổi lớn ở kiểu hình KSTSR, đặc biệt là trong các giá trị IC50 in vitro, hoặc kiểu gen đã được phát hiện trong các loại KSTSR tìm thấy ở Campuchia. Tính chất này khác với các loại thuốc chống sốt rét khác là những thay đổi trong giá trị IC50 in vitro thường được quan sát thấy trong ký sinh trùng kháng thuốc. Trong khi rõ ràng là các ký sinh trùng đang thích ứng với áp lực của artemisinins, các cơ chế về hiện tượng này chưa được biết rõ. Nếu không có một kiểu hình hoặc chỉ điểm phân tử (marker) điển hình rất khó để theo dõi là có sự phát triển của KSTSR kháng artemisinins. Tại sao đơn trị liệu artemisinins liên quan với tỷ lệ tái phát cao? Làm thế nào để artemisinins kết hợp thuốc khác làm giảm tái phát? Lời giải thích cho thời gian chậm làm sạch KSTSR quan sát thấy ở Campuchia là gì? Một sự hiểu biết sâu hơn về những câu hỏi quan trọng này có thể giúp bảo vệ hiệu quả của artemisinins và dẫn suất cũng như các phối hợp ACTs. Xem xét các dữ liệu sẵn có từ các công trình nghiên cứu để giải quyết những câu hỏi này. Các nguyên nhân chính gây ra tái phát: Artemisinin-gây ra trạng thái ngủ Một số giả thuyết đặt ra hiện nay Định nghĩa về điều trị thất bại (WHO, 2010a) Điều trị thất bại được xác định là thuốc chống sốt rét không có khả năng làm sạch KSTSR hoặc giải quyết các triệu chứng lâm sàng mặc dù đã được điều trị. Điều trị thất bại không những do kháng thuốc, mà còn có sự đóng góp của nhiều yếu tố khác, chủ yếu là do giảm nồng độ thuốc. Những yếu tố bao gồm: liều lượng không đủ, sự tuân thủ liệu trình uống thuốc của bệnh nhân không đạt được, dùng 1 hoặc 2 liều hoặc thời gian điều trị không đủ, chất lượng thuốc kém (thậm chí thuốc giả) và do sự tương tác các thuốc với nhau. Định nghĩa này hiện nay đã có sự thay đổi theo thời gian (WHO, 2014 và WHO, sept. 2015) có bổ sung chỉ điểm đột biến kháng gen K13. Năm 1996 Kyle và Webster cho biết sự phát triển thể tư dưỡng sớm của KSTSR P. falciparum bị gián đoạn sau khi tiếp xúc với AS hoặc dihydroartemisinin (DHA) - một chất chuyển hóa của artemisinins; các ký sinh trùng còn sống sót dưới hình thức ngưng hoạt động trong vòng 3-8 ngày trước khi tiếp tục phát triển bình thường. Quan sát này đã khiến họ đưa ra giả thuyết rằng một số KSTSR được điều trị bằng artemisinins đi vào “trạng thái ngủ”, ở hình thức này chúng được bảo vệ khỏi các tác động gây chết của thuốc, nhưng hồi phục vào thời gian sau đó để tiếp tục phát triển bình thường. Các hiện tượng này tương tự như các nghiên cứu về tác dụng của thuốc kháng sinh đối với vi khuẩn. Cùng thời gian, Bwijo và cộng sự sử dụng một liều lặp đi lặp lại trong mô hình in vitro thử nghiệm để mô phỏng dược động học in vivo của artemisinins. Kết quả cho thấy khi tiếp xúc với artemisinins (tần số 3 giờ, mỗi ngày một lần) số lượng KSTSR P.falciparum thể vô tính trên in vitro giảm đến mức rất thấp, nhưng các KSTSR không hoàn toàn bị tiêu diệt, ngoại trừ khi họ sử dụng nồng độ artemisinin ≥10 µM. Thời gian “bùng nổ” của sự tăng trưởng KSTSR trong nuôi cấy có liên quan đến liều lượng, tần số và thời gian tiếp xúc với thuốc. Một mô hình toán học lý thuyết trong điều trị với AS cũng được đề xuất trong đó bao gồm cả trạng thái ngủ. Các mô hình đầu ra được hỗ trợ cho giả thuyết trạng thái ngủ và nhấn mạnh tầm quan trọng của trạng thái ngủ trong việc lựa chọn phác đồ điều trị tối ưu với AS. Tuy nhiên, cần nghiên cứu toàn diện hơn và có các bằng chứng của phòng thí nghiệm về lĩnh vực này để xác nhận điều giả thuyết này. Bằng chứng in vitro Để nghiên cứu sâu hơn các giả thuyết của thể ngủ trong nghiên cứu in vitro, tiến hành một tiếp xúc đơn 6 giờ với 200 ng/ml (~7 x 10-7 M) DHA, được so sánh với nồng độ DHA trong huyết thanh ở bệnh nhân điều trị với các dẫn xuất ART. Kết quả cho thấy sự phát triển của ký sinh trùng giai đoạn tư dưỡng đột ngột bị chặn lại khi tiếp xúc với DHA và ký sinh trùng đi vào trạng thái không hoạt động (thể ngủ) kéo dài đến 20 ngày. Những KSTSR thể ngủ có đặc điểm hình thái riêng biệt: không có sự hiện diện của không bào, tế bào chất được cô đặc và tụ lại về phía nhân và nhân cũng co lại. Mặc dù phần lớn các ký sinh trùng chết trong trạng thái này, một tỷ lệ hồi phục để trở thành KSTSR phát triển với một hình thái bình thường giữa 3 và 20 ngày sau điều trị. Tỷ lệ hồi phục tổng thể từ thể ngủ được ước tính vào khoảng 0,044-1,313%, phụ thuộc vào chủng KSTSR và liều điều trị. Khoảng 50% KSTSR thể ngủ hồi phục và tăng trưởng trở lại trong vòng 9 ngày điều trị. Sử dụng hệ thống thử nghiệm này, các tác giả chứng minh rằng thể ngủ có thể dễ dàng xảy ra trong giai đoạn tư dưỡng của P. falciparum. Hơn nữa, các nghiên cứu cho thấy điều trị với DHA lặp đi lặp lại 3 ngày liên tiếp, 6 giờ mỗi ngày, làm giảm thể ngủ xuống gấp 10 lần mức bình thường, cho thấy tầm quan trọng của việc sử dụng một phác đồ điều trị artemisinin kéo dài. Làm thế nào để thuốc phối hợp ACTs có tác dụng làm giảm tái phát sớm? Vai trò chính của artemisinin trong phối hợp ACTs là để làm giảm nhanh chóng sự nhân lên của KSTSR gây bệnh xuống gần 104 lần mỗi 48 giờ, trong khi các loại thuốc phối hợp cùng (partner drugs) với artemisinin sẽ làm sạch lượng ký sinh trùng còn lại. Tuy nhiên, không có bằng chứng trực tiếp, chính xác cho các cơ chế mà thuốc đồng tác dụng làm giảm tái phát. Các thuốc đồng tác dụng, thường là những thuốc tác dụng kéo dài, có thể trực tiếp diệt KSTSR thể ngủ hoặc diệt KSTSR sau khi hồi phục từ thể ngủ, hoặc cả hai. Để làm sáng tỏ cơ chế này, Teuscher và cộng sự đã cho KSTSR tiếp xúc với DHA trên mô hình thử nghiệm in vitro trong 6 giờ và với mefloquin trong 24 giờ. Mefloquine được loại bỏ hết sau 24 giờ để chắc chắn rằng KSTSR hồi phục từ thể ngủ không còn tiếp xúc với thuốc. Cột từ tính được sử dụng hàng ngày sau khi điều trị với DHA để loại bỏ bất kỳ KSTSR nào không bị ảnh hưởng bởi DHA trong cả hai trường hợp DHA dùng một mình và DHA kết hợp với mefloquin. Kết quả so sánh cho thấy tỷ lệ KSTSR hồi phục giảm 10 lần và sự hồi phục chậm hơn so với sử dụng DHA một mình. Điều này chứng minh rằng mefloquin có ảnh hưởng trực tiếp trên KSTSR giai đoạn hay “trạng thể ngủ”. Mefloquin có thời gian bán hủy dài khoảng 2 tuần, nên mefloquine cũng có thể diệt bất kỳ KSTSR nào hồi phục từ thể ngủ in vivo, do đó tác dụng diệt KSTSR tái phát tổng thể cao hơn so với những gì quan sát chỉ với 24h trong thực nghiệm in vitro. Bằng chứng in vivo Trái ngược với các số liệu in vitro, đến nay chưa có báo cáo nào cho rằng KSTSR trạng thái ngủ tồn tại trong cơ thể sau khi điều trị với artemisinins. Điều này có thể chỉ đơn giản là do các nhà nghiên cứu không nhận ra KSTSR bất bình thường trong xét nghiệm lam máu của bệnh nhân sau điều trị. Có thể do các cơ quan trong cơ thể như lách bị tổn thương nghiêm trọng và KSTSR chết trong các hồng cầu bị nhiễm và chỉ để lại một tỷ lệ rất nhỏ KSTSR trạng thái ngủ hiện diện ở mật độ dưới ngưỡng phát hiện của kính hiển vi. Để nghiên cứu xem, liệu thể ngủ có xảy ra trong cơ thể hay không? LaCrue và cộng sự phát triển một mô hình sốt rét của loài gặm nhấm bằng cách sử dụng đồng bộ chủng P. vinckei petteri (không gây tử vong) và P. vinckei (gây tử vong), trong đó sự phát triển của KSTSR giai đoạn hồng cầu là tương đối đồng bộ và mật độ KSTSR thường xuyên đạt 40%. Những con chuột bị nhiễm được điều trị bằng AS ở các giai đoạn phát triển khác nhau của KSTSR. Kết quả cho thấy cả hai chủng không gây chết người và gây chết người, các KSTSR giai đoạn tư dưỡng là dễ điều trị nhất và sau điều trị 24 giờ, KSTSR ở trạng thái ngủ có hình dáng tương tự như P. falciparum đã được quan sát thấy trong in vitro. Một thí nghiệm gây nhiễm cũng đã được tiến hành, trong đó KSTSR trạng thái ngủ sau điều trị từ chuột cho được chuyển cho những con chuột nhận trong các nhóm khác nhau. Thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm này xác định một tương quan thuận giữa số KSTSR trạng thái ngủ chuyển giao và thời gian để KST đạt 5% trong cả hai con chuột nhận có lách còn nguyên vẹn và đã bị cắt bỏ lách. Tỷ lệ hồi phục được ước tính là 1 trong 400 KSTSR trạng thái ngủ tương tự như tìm thấy trong in vitro. Kết quả cũng cho thấy khi được tiêm vào những con chuột bị cắt bỏ lách, KSTSR trạng thái ngủ cần thời gian để hồi phục ít hơn so với những con chuột còn nguyên vẹn lách và trong những con chuột cắt bỏ lách, KSTSR tồn tại thấp hơn so với trong nhóm còn lách nguyên vẹn. Những dữ liệu này đã chứng minh rõ ràng vai trò của lách trong sự làm sạch KSTSR sau điều trị, cũng như thể tư dưỡng trạng thái ngủ còn tồn tại trong lách. Cơ chế chính của sự tái phát sau điều trị artemisinins Nói chung, các dữ liệu cho thấy rằng thể ngủ xảy ra trong in vitro và in vivo là một cơ chế hợp lý cho tỷ lệ tái phát cao được quan sát thấy sau đơn trị liệu bằng artemisinin. Kiểu hình KSTSR này có nghĩa là artemisinins bắt buộc chỉ được sử dụng kết hợp với thuốc sốt rét khác. Bằng chứng về trạng thái ngủ của thể tư dưỡng trong thử nghiệm ở động vật và ở những bệnh nhân được điều trị bằng artemisinins cùng với bằng chứng về mối tương quan giữa thể tư dưỡng trạng thái ngủ và tái phát sẽ củng cố cơ chế này. Một sự hiểu biết sâu hơn là tại sao một tỷ lệ KSTSR trạng thái ngủ tồn tại in vivo và trong ex vivo, xem xét các bằng chứng cho thấy KSTSR giai đoạn tư dưỡng và KSTSR sau khi bị tác động bởi artemisinins vẫn được duy trì hoặc tồn tại trong lách cũng sẽ giúp xác nhận mối liên quan giữa thể ngủ và tái phát lâm sàng.
Tại sao không phải tất cả các bệnh nhân tái phát? Dựa trên tỷ lệ hồi phục được công bố, một bệnh nhân mang 1 x 1010 KSTSR giai đoạn tư dưỡng (~ 2000 KSTSR/µL) sẽ có 4 x 105 ký sinh trùng hồi phục sau điều trị bằng artemisinins. Ngay cả khi tỷ lệ KSTSR giảm thêm 10 hoặc 100 lần bằng điều trị lặp lại với artemisinins đơn trị liệu, tất cả các bệnh nhân vẫn còn đủ số lượng KSTSR hồi phục và tái phát. Vậy thì tại sao không xem xét tất cả các bệnh nhân tái phát? Có khả năng là các chủng KSTSR khác nhau, có tỷ lệ hồi phục khác nhau từ thể ngủ. Bởi vì tỷ lệ thất bại điều trị liên quan chặt chẽ với tỷ lệ KSTSR hồi phục từ hàng loạt các thể ngủ khác nhau làm cho kết quả điều trị thay đổi. Ngoài ra, khả năng miễn dịch của vật chủ có thể đóng một vai trò quan trọng. Codd và cộng sự tiến hành một nghiên cứu lý thuyết kết hợp in vitro về các đặc tính của KSTSR thể ngủ với mô hình nhiễm P. falciparum. Kết quả chứng minh ước tính tỷ lệ KSTSR và thất bại trong điều trị lâm sàng phù hợp với những kết quả thử nghiệm tại thực địa khi các đáp ứng kháng thể của vật chủ, protein-1 của màng hồng cầu (PfEMP1), một protein được sản xuất bởi các biến thể gen làm thay đổi tính kháng nguyên P. falciparum. Trong trường hợp không có đáp ứng miễn dịch, tất cả bệnh nhân được dự đoán thất bại với đơn trị liệu artemisinins. Liệu trạng thái ngủ xảy ra duy nhất với các hợp chất artemisinins Một câu hỏi quan trọng là liệu hiện tượng ngủ xảy ra duy nhất cho các hợp chất của artemisinins hay nó xảy ra đối với các thuốc sốt rét khác. Đến nay, chưa một báo cáo hệ thống trong thử nghiệm hiệu quả các loại thuốc khác nhau gây ra thể ngủ của KSTSR. Các báo cáo vẫn còn KSTSR hồi phục trên thử nghiệm in vitro sau khi điều trị với pyrimethamine, sorbitol và mefloquin. Dựa vào các khoảng thời gian hồi phục tương tự sau khi các điều trị khác nhau và không có sự thay đổi tính nhạy cảm với các thuốc chống KSTSR sau khi hồi phục, các tác giả kết luận rằng còn một tỷ lệ nhỏ KSTSR (ước tính khoảng 100 trong 107 KSTSR) có khả năng sống sót sau điều trị và các KSTSR không kháng với thuốc. Tuy nhiên, sự khác biệt cơ bản giữa các kết quả này và liều sử dụng artemisinins là khoảng thời gian hồi phục độc lập với liều điều trị, nhưng tương quan với số lượng KSTSR ban đầu và thời gian điều trị. Điều này có thể đề xuất một cơ chế khác nhau về artemisinins gây nên “thể ngủ” hay trạng thái ngủ của KSTSR. Liệu thể ngủ có phải là một cơ chế bảo vệ bẩm sinh cho tất cả KSTSR? Teuscher và cộng sự thử nghiệm 05 chủng P. falciparum có nguồn gốc di truyền khác nhau và nhận thấy tất cả chủng có khả năng trở thành thể ngủ sau khi tiếp xúc với DHA, mặc dù tỷ lệ hồi phục có khác nhau giữa các chủng. Điều này cho thấy artemisinins gây ra thể ngủ là một đặc điểm được bảo tồn của KSTSR P. falciparum. Giả thuyết thể ngủ là một cơ chế bảo vệ bẩm sinh mà KSTSR sử dụng để tồn tại trong một số điều kiện bất lợi. Nó có thể không cụ thể với artemisinins, nhưng khá cụ thể với các loại thuốc khác tác động vào giai đoạn đầu của chu kỳ hồng cầu. Thể ngủ do artemisinins gây ra là một phản ứng “bẩm sinh” của KSTSR với những điều kiện bất lợi và KSTSR có thể tạm ngưng phát triển đến 20 ngày. Sau khi nồng độ thuốc giảm, một tỷ lệ nhỏ KSTSR ở trạng thái ngủ hồi phục và tiếp tục tăng trưởng, gây ra tái phát hoặc điều trị thất bại. Các hiệu quả cao của ACTs đạt được bằng các thuốc hiệp đồng tác dụng, sẽ tác động trực tiếp vào các KSTSR thể ngủ nên trong trường hợp này, thuốc đồng tác dụng có thời gian tác dụng dài, ức chế trực tiếp sự hồi phục và tăng trưởng của KSTSR. Lan rộng các alen kháng artemisinin tại Thái Lan trước khi ngăn chặn kháng toàn cầuSự xuất hiện kháng thuốc artemisinin ở khu vực tiểu vùng sông Mekong cho thấy một mối đe dọa nghiêm trọng cho các nổ lực PCSR toàn cầu. Truy tìm sự lan rộng và tiến triển của KSTSR kháng artemisinin nhằm hỗ trợ các nổ lực ngăn chặn sốt rét kháng thuốc. Tổng số 417 mẫu bệnh nhân thu thập từ năm 2007 trong quá trình giám sát sốt rét khắp 10 tỉnh của Thái Lan, để định kiểu gen cho ứng cử viên các chỉ điểm phân tử kháng artemisinin do P. falciparum - K13. Các kiểu gen của KSTSR được xác định đột biến K13 propeller liên quan kháng artemisinin,các tín hiệu tốt chọn lọc trong kháng và là bằng chứng có hay không các alen kháng artemisinins đang gia tăng tại Thái Lan. Tổng số 07 alen đột biến K13 được tìm thấy (N458Y, R539T, E556D, P574L, R575K, C580Y, S621F). Đáng chú ý, loại đột biến R575K và S621F mà trước đây chưa được báo cáo tại Thái Lan. Loại đột biến phổ biến hay gặp nhất liên quan đến kháng thuốc K13 artemisinins là C580Y được tiến hành trên các haplotype rofiles riêng biệt được làm rõ dựa trên các vùng địa lý dọc theo biên giới Thái Lan-Campuchia và Thái Lan-Myanmar. Dường như hai haplotype này óc thể có nguồn gốc tiến hóa hoàn toàn độc lập nhau. Nhìn chung, các KSTSR có đột biến K13 propeller có liên quan đến kháng artemisinins hiện nay lan rộng dọc theo biên giới Thái Lan-Campuchia và Thái Lan-Myanmar trước khi thiết lập chương trình ngăn chặn kháng artemisinin ở trong vùng này. KSTSR P. falciparum gây sốt rét biểu hiện kháng với hầu hết các thuốc sẵn có, kể cả artemisinins. Hiện tại, kháng artemisinin đang xảy ra tại một số quốc gia trong tiểu vùng sông Mêkong, kể cả Campuchia, Thái Lan, Myanmar và Việt Nam. Về lịch sử, vùng biên giới Thái Lan-Campuchia như một tâm điểm của kháng thuốc (epicenter of resistance). Để ngăn chặn lan rộng KSTSR kháng thuốc artemisinin từ khu vực tiểu vùng Mêkông, một sự án ngăn chặn kháng đã khỏi động năm 2009. Ỏ đây, các đột biến gen kháng K13 đã cho thấy xuất hiện khắp Thái Lan vào đầu năm 2007, trước tiên dọc theo biên giới Thái Lan-Campuchia và Thái Lan-Myanmar. Các dữ liệu bổ sung dựa trên các nghiên cứu chỉ điểm kháng vệ tinh (microsatellite markers) coh thấy hầu hết alen kháng K13 loại C580Y có thể độc lập so với các vùng khác trong biên giới Campuchia và Myanmar. Transcriptomics quần thể của KSTSR biểu hiệncơ chế kháng artemisininNhóm tác giả Sachel Mok và cộng sự (2015) cho biết kháng artemisinin do P. falciparum đe dọa các thành quả do nổ lực toàn cầu mang lại trong phòng chống và loại trừ sốt rét gần đây. Tính đa hình trong vùng Kelch mang protein K13 có liên quan đến kháng artemisinin, nhưng cơ chế phân tử vẫn còn chưa rõ ràng. Các nhà khoa học đã phân tích trên in vivo transcriptomes của 1.043 phân lập P. falciparum từ các bệnh nhân sốt rét cấp tính và tìm thấy kháng artemisinin có liên quan đến trình diện tăng lên của các con đường đáp ứng protein lộ ra (unfolded protein response_UPR) liên quan đến các PROSC chủ yếu và phức hợp TRiC chaperone.
Các KSTSR kháng artemisinin cũng biểu hiện tiến triển chậm lại thông qua phần đầu tiên của chu kỳ phát triển thể vô tính trong hồng cầu. Điều này cho thấy rằng các KSTSR kháng artemisinin vẫn trong một tình trạng phát triển chậm ở thể nhẫn trẻ, ngược lại con đường điều hòa up-regulated UPR của chúng làm giảm nhẹ tổn thương protein do thuốc artemisinin. Hồ sơ về trình diện của các các gen liên quan UPR enes cũng liên quan đến nguồn gốc địa lý của các phân lập KSTSR, ngoài ra vai trò của chúng trong xuất hiện kháng tại khu vực tiểu vùng sông Mekong. Nghiên cứu về thời gian thật sự tiến triển kháng artemisinin do P. falciparum Các thay đổi về mặt di truyền đơn giản cho thấy có liên quan đến kháng thuốchiện đang thực hiện thường quy để xác định như các tác nhân kháng do vi khuẩn. Các chỉ điểm phân tử này đã cho thấy được xác định sau khai kiểu hình kháng được lưu ý. Các thay đổi về phân tử ở điểm kết phản ánh một quá trình tiến triển phức tạp và lâu dài của sự biến đổi di truyền, nhưng một khikháng xảy ra nghiêm trọng cùng với chọn lọc thuốc thì kiểu hình có thể trở nên cố định và tác nhân gây kháng thuốc sẽ lan rộng.
Artemisinins hiện đang được sử dụng trên toàn cầu để điều trị sốt rét do P. falciparum, nhưng đáp ứng KSTSR đã giảm đi nhanh chóng trong vùng Mêkông của Đông Nam Á. Liệu artemisinins có mất tiềm năng hoàn toàn hay không và điều này ảnh hưởng đến toàn cầu, hiệu quả điều trị của bệnh. Một loạt các phương pháp hiện đại đa được ứng dụng để xác đinh nhanh chóng các thay đổi về mặt di truyền. Các thay đổi đó liên quan đến kháng artemisinin rất phức tạp và hình như diễn ra nhanh chóng, đặc biệt tại khu vực Đông Nam Á. Đây là cơ hội hiếm có để quan sát các giai đoạn sớm trong quá trình tiến triển kháng và phát triển chiến lực để làm giảm xu hướng cũng như bảo vệ các thuốc quan trọng nhất. Dữ liệu di truyền quan trọng về kháng artemisinin đã hé lộCác nhà khoa học NDM dẫn đầu nhóm nghiên cứu về bô gen mở rộng của P. falciparum. Nghiên cứu mới này đã ấn bản trên tạp chí Nature Genetics mở màn cho một kiến trúc di truyền phức tạp có thể làm cho KSTSR phát triển kháng với hầu hết các thuốc có hiệu lực nhất, kể cả artemisinin. Kết quả nghiên cứu có thể giúp cải thiện việc phát hiện sớm kháng artemisinin xảy ra ở bất cứ nơi nào. Nhóm nghiên cứu toàn cầu đã phân tích 1.612 mẫu tử 15 vùng khác nhau ở Đông Nam Á và châu Phi và họ đã tìm thấy 20 loại đột biến trên gen kelch13, một chỉ điểm phân tử kháng artemisinins hỗ trợ cho cơ chế kháng sâu hơn. Chúng ta đang ở vào thời điểm mấu chốt của chiến lược PCSR. Trong khi số ca tử vong do sốt rét đã giảm phân nửa, tiến trình này sẽ là nguy cơ nếu đặt artemisinin không còn hiệu quả nữa - giáo sư Nick Day cho biết, nên cần một công cụ hữu ích hơn để bảo vệ nhóm thuốc này. Giám sát KSTSR kháng thuốc để phát hiện các đột biến có thể cung cấp các dữ liệu cho hệ thống cảnh báo sớm (early warning system), nhằm xác định vùng có nguy cơ kháng artemisinin. Các nhà nghiên cứu cũng đưa ra các bằng chứng mới về kháng thuốc artemisinin như thế nào ở Đông Nam Á. Bằng cách so sánh KSTSR giữa Campuchia, Việt Nam, Lào, Thái Lan và Myanmar, Bangladesh, các nhà khoa học tìm thấy sự phân bố các đột biến kelch13 khác nhau tại các vùng địa lý khác. Đột biến gen kelch13 hiện hữu, nhưng hiếm ở châu Phi nhưng khong liên quan đến kháng artemisinin và thiếu các cơ sở di truyền như kháng artemisinin ở Đông Nam Á. Điều này cung cấp cho các nhà làm chính sách y tế nền tảng để làm việc ngăn chặn lan rộng kháng artemisinin đến châu Phi, nơi mà số ca tử vong do sốt rét nhiều nhất. Hiện có nhiều câu hỏi chưa được trả lời, chưa biết vai trò cơ bản của các đột biến - TS. Olivo Miotto, một tác giả đầu tiên và là nhà nghiên cứu thông tin kỳ cựu của đơn vị MORU và Trung tâm di truyền học và Sức khỏe toàn cầu cho biết. Một số có thể không ảnh hưởng trực tiếp đến kháng thuốc, nhưng chúng lại là một nguồn môi trường tốt mà ở đó các đột biến kháng thuốc trở nên dung nạp. Vì kelch13 chỉ vừa mới thay đổi trong vòng 50 triệu năm tiến háo của KSTSR Plasmodium, chúng ta có thể ước tính gen này là cần thiết cho sự sống sót của KSTSR. Do đó, các đột biến kelch13 có thể là các đột biến khuyết tật nghiêm trọng của KSTSR. Các dữ liệu này đóng vai trò như một điểm cần thiết trong giám sát và chương trình loại trừ sốt rét nên chú ý. Hiện tại kháng thuốc artemisinin dường như nghiêm trọng ở Đông Nam Á nhưng thực trạng này có thể thay đổi khi quần thể KSTSR tiếp tục tiến hóa, phát triển thêm. Bằng cách liên kết các dữ liệu gen học, chúng ta đang phát triển một sự hiểu biết đa yếu tố di truyền trong sự xuất hiện kháng thuốc. Không có ngưỡng làm sạch 50% dung khối KSTSR nào để định nghĩa kháng artemisinin Các dữ liệu từ Đông Nam Á, nơi mà chủng kháng thuốc đang nghiêm trọng và phát hiện lần đầu tiên, sau đó được sự giúp đỡ của nhóm TCYTTG để định nghĩa kháng thuốc artemisinins, nhưng các định nghĩa hiện tại đòi hỏi các cải tiến quan trọng, theo một nghiên cứu vởi Lisa White từ ĐH Mahidol, Thái Lan ấn bản trên PLOS Medicine. Thuốc artemisinin làm sạch nhanh chóng dung khối KSTSR trong máu bệnh nhân sốt rét , trừ khi ký sinh trùng phát triển kháng thì thời gian làm sạch sau khi dùng liệu pháp artemisinin ACTs kéo dài hơn. Biện pháp tốt nhất làm sạch KSTSR là thời gian diệt sạch 50% dung khối KSTSR trong máu một bệnh nhân được xác định để đánh giá kháng artemisinin là 5 giờ. Nghiên cứu chỉ ra rằng thời gian làm sạch 50% dung khối KSTSR (parasite half-life) tiên đoán cho khả năng nhiễm loại KSTSR kháng artemisinin, nhưng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác nữa. Ngưỡng tơi hạn của thời gian làm sạch 50% này thay đổi từ 3.5 giờ (trong vùng hiếm khi có kháng xảy ra) đến 5.5 giờ (trong vùng có kháng xảy ra thường xuyên). Điều này cho thấy không có ngưỡng thống nhất toàn cầu (universal cut-off value) trong việc làm sạch KSTSR mà ở đó có thể xác định ca đó nhiễm trùng chủng ngạy hay kháng thuốc. Vì đo lường thời gian làm sạch 50% dung khối KSTSR đòi hỏi lấy máu thường xuyên sẽ rất khó khăn để thực hiện, TCYTTG sử dụng định nghĩa thực hành đẻ giám sát kháng artemisinin trong một quần thể, nghi ngờ nếu hơn 10% số bệnh nhân vẫn còn mang KSTSR sau 3 ngày điều trị ACTs. Việc tranh luận về ngưỡng làm sạch trong đinh nghĩa của TCYTTG dựa trên các dữ liệu hạn hữu, các nhà nghiên cứu kiểm tra làm thế nào định nghĩa này phù hợp với các dữ liệu thật của bệnh nhân có mang KSTSR kháng thuốc artemisinin. Ứng dụng một mô hình phát triển chuyên biệt cho mục đích này, các nhà nghiên cứu tìm thấy giá trị theo TCYTTG có tồn tại KSTSR ngày D3 trên 10% là có giá trị ('day-3' cut-off value of 10%), nhưng có thể cung cấp thông tin tốt nếu dung khối KSTSR ở thời điểm bắt đầu dùng thuốc ACTs được kiểm tra và đếm đầy đủ. Các tác giả cũng kết luận rằng định nghĩa WHO nhìn chung là một cong cụ hữu ích để xác định vùng nghi ngờ kháng artemisinin, nhưng thiếu tính chính xác trong tiên đoán tỷ lệ thật sự KSTSR kháng artemisinin và do đó nên đánh giá chi tiết hơn. Tính nguy hiểm của P. falciparum kháng artemisinins ở châu Phi Châu Phi được coi là gánh nặng sốt rét cao nhất thế giới và 90% số ca tử vong xảy ra ở châu Phi. Tỷ lệ tử vong do P. falciparum là cao nhất trong 5 chủng KSTSR (P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, P. knowlesi). Artemisinins là thuốc đầu tay trong điều trị sốt rét tài hầu khắp các châu lục, tiếc thay chúng bị kháng bởi P. falciparum và có nguy cơ lan rộng từ Đông Nam Á sang châu Phi như đã từng xảy ra với các thuốc sốt rét cổ điển. Kinh nghiệm trong quá khứ cho thấy mức độ nguy hiểm khi kháng lan rộng khắp thế giới. Vào những năm 1970-1980, P. falciparum kháng thuốc chloroquin, sulfadoxine-pyrimethamine khắp khu vực cận sa mạc Sahara, châu Phi, gây ra số ca tử vong do sốt rét. Ngày này, Plasmodium falciparum đã giết rất nhiều trẻ em châu Phi hơn bất kỳ bệnh nào khác. Nghiên cứu chỉ điểm phân tử kháng artemisinins Tương tự như kháng thuốc của virus và vi khuẩn, kháng do P. falciparum khi đột biến xảy ra cho phép ký sinh trùng sống sót ở liều điều trị của artemisinin. Các thay đổi về mặt phân tử phản ánh một sự thay đổi về mặt di truyền tiến hóa phức tạp và lâu dài, nhưng một khi kháng xảy ra vững bền các thay đổi về mặt di truyền sẽ tập hợp lại dưới điều kiện chọn lọc thuốc, các kiểu gen có thể trở nên cố định và các tác nhân kháng sẽ lan rộng nhanh chóng. Do đó, điều trị hàng loạt có đích là một chiến lược nguy cơ cao, nếu không thành công nó sẽ lựa chọn chủng KSTSR kháng thuốc nhất. Các nhà nghiên cứu sốt rét sử dụng các nghiên cứu liên quan đến bộ gen mở rộng (genome-wide association studies_GWAS) để tìm các đột biến liên quan đến Plasmodium kháng vớiartemisinin. Cuối năm 2014, các nhà di truyền học xác định hơn 30 loại đột biến trên vùng “propeller” của gen PfKelch13, một đồng phân của bộ phận thích ứng của động vật có vú đối vớiE3 ubiquitin ligase, như các chỉ điểm phân tử của P. falciparum kháng artemisinin. Mỗi cái gọi là đột biến K13 là sự thay đổi một amino acid trong vùng propeller của gen. Thay vì, các đột biến K13 được xác định ở tỷ lệ thấp (< 5%) trên hầu hết các nơi ở châu Phi được kiểm tra; 25 alen đột biến K13 được xác định, thì có 21 đột biến là mới và 04 đột biến khác đã xác định trước đây ở Đông Nam Á. Khi các KSTSR nhạy với artemisinins được kiến tạo để trình diện một alen đột biến K13 thường gặp tại Campuchia, chúng sẽ được bảo vệ chống lại sự phơi nhiễm artemisinin trong la bô; thử nghiệm các alen châu Phi trong hệ thống này có thể là bước đầu tiên trong việc xác định tầm quan trọng của các alen mới này của KSTSR đáp ứng với artemisinin. Ngoài ra, Mbenque và cộng sự còn tìm thấy các đột biến K13 kháng artemisinins thông qua sự gia tăng tính ổn định của thành phần P. falciparum phosphatidylinositol-3-kinase (PfPI3K) mà sinh ra tín hiệu lipid phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P). PI3P là một lipid quan trọng để xuất các protein điều hòa độc lực KSTSR nội bào trong hồng cầu. Trong khi artemisinin có các đích khác trong giai đoạn KSTSR muộn, thì PfPl3K là đích đầu tiên được xác định trong thể nhẫn sớm khi Plasmodium ở trong hồng cầu. Giám sát phân tử trên chủng P. falciparum kháng artemisinins Biết về các gen kháng cũng làm cho có khả năng thử nghiệm vai trò làm cha (“paternity testing”) của P. falciparum kháng artemisinin để tìm ra có hay không ổ kháng mới biểu hiện lan rộng từ một nơi nào đó hoặc xuất hiện độc lập của KSTSR kháng thuốc. Do đó, các nhà nghiên cứu sốt rét thiết lập hệ thống giám sát phân tử quy mô lớn (large-scale molecular surveillance) ở Đông Nam Á dựa trên phát hiện các đột biến kháng artemisinin, sử dụng các kỹ thuật rẻ tiền và đơn giản bao gồm các mẫu máu mao mạch trên giấy thấm để tách chiết DNA và làm phản ứng PCR, giải trình tự phát hiên đột biến gen. Tiếc thay, giám sát này cho thấy cả sự lan rộng và kháng thuốc artemisinin độc lập mới. Các thử nghiệm này đặt ra câu hỏi nên dựng bức tường lửa chống lại làn sóng kháng artemisinin di chuyển từ Campuchia qua Myanmar đến Bangladesh và Ấn Độ, rồi đến châu Phi. Năm 2013, Trung tâm sốt rét quốc gia Campuchia và Viện sức khỏe Mỹ, Viện Pasteur Campuchia phát triển hai xét nghiệm la bô để phân biệt P. falciparum trên các bệnh nhân có nhạy hay kháng với thuốc artemisinin trong một thời gian 3 ngày. Thử nghiệm sống còn của thể nhẫn (the ring-stage survival assay_RSA), có tên gọi ám chỉ đến các KSTSR còn trẻ hình nhẫn trong hồng cầu chuyển thành hai phiên bản: ex vivo RSA và in vitro RSA. Thử nghiệm ex vivo RSA dễ dàng thiết lập có thể ứng dụng vứi mục đích giám sát quy mô lớn. Trong thử nghiệm này, các mẫu máu đơn thuần được lấy trên các bệnh nhân sốt rét. KSTSR trong máu sẽ được nuôi cấy với sự có mặt của liều thuốc trong một vài giờ. Mức đồ kháng được đánh giá sau 3 ngày dựa trên ký sinh trùng sống sót khi cho phơi nhiễm với điều trị. Số lượng KSTSR cao hơn con lại là mức độ kháng sẽ cao hơn. Trong khi đó, nghiên cứu in vitro RSA được áp dụng đối với loài P. falciparum trong hai tuần nuôi cấy KSTSR. Nó cho phép các bác sĩ xác định tốt hơn các giai đoạn phát triển chính xác mà ở đó KSTSR kháng thuốc artemisinin xảy ra. Mặc dù các thử nghiệm la bô mới và giám sát mức độ phân tử có thể ngăn chặn kháng artemisinin tại chỗ trong chiến lược lâu dài. Tài liệu tham khảo 1.Talisuna AO et al. (2012) Mitigating the threat of artemisinin resistance in Africa: improvement of drug-resistance surveillance and response systems. Lancet Infectious Diseases, 12(11): 888-896. 2.Wootton JC(, Feng X, Ferdig MT, Cooper RA, Mu J, Baruch DI, Magill AJ, Su XZ. (2002) Genetic diversity and chloroquine selective sweeps in Plasmodium falciparum. Nature, 418(6895), 320-323. 3.Roper C, Pearce R, Nair S, Sharp B, Nosten F, Anderson T. (2004) Intercontinental spread of pyrimethamine-resistant malaria. Science; 305(5687); 1124. 4.Mita T, Venkatesan M, Ohashi J, Culleton R, Takahashi N, Tsukahara T, Ndounga M, Dysoley L, Endo H, Hombhanje F, Ferreira MU, Plowe CV, Tanabe K. (2011) Limited geographical origin and global spread of sulfadoxine-resistant dhps alleles in Plasmodium falciparum populations. J Infect Dis., 204(12), 1980-1988. 5.Ariey F et al. (2014) A molecular marker of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria. Nature, 505(7481), 50-55. 6.Conrad MD, Bigira V, Kapisi J, Muhindo M, Kamya MR, Havlir DV, et al. (2014) Polymorphisms in K13 and falcipain-2 associated with artemisinin resistance are not prevalent in Plasmodium falciparum isolated from Ugandan children. PLoS one;9:e105690. 7.Kamau E, Campino S, Amenga-Etego L, Drury E, Ishengoma D, Johnson K, et al. (2014) K13-propeller polymorphisms in Plasmodium falciparum parasites from sub-Saharan Africa. J Infect Dis. doi: 10.1093/infdis/jiu608. 8.Taylor SM, Parobek CM, DeConti DK, Kayentao K, Coulibaly SO, Greenwood BM, et al. (2015) Absence of putative artemisinin resistance mutations among Plasmodium falciparum in sub-Saharan Africa: A molecular epidemiologic study. J Infect Dis., 211, 680-688. 9.Torrentino-Madamet M, Fall B, Benoit N, Camara C, Amalvict R, Fall M, et al. (2014) Limited polymorphisms in k13 gene in Plasmodium falciparum isolates from Dakar, Senegal in 2012-2013. Malar J., 13, 472. 10.Ghorbal M, Gorman M, Macpherson CR, Martins RM, Scherf A, Lopez-Rubio JJ. (2014) Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nat Biotechnol., 32, 819-821. 11.Straimer J, Gnadig NF, Witkowski B, Amaratunga C, et al. (2015) Drug resistance. K13-propeller mutations confer artemisinin resistance in Plasmodium falciparum clinical isolates. Science, 347(6220), 428–431. 12.Alassane Mbengue, Souvik Bhattacharjee, et al. (2015) A molecular mechanism of artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria, Nature, 520, 683-687. 13.Elizabeth A. Ashley et al. (2014) Spread of Artemisinin Resistance in Plasmodium falciparum Malaria, N Engl J Med, 371, 411-423. 14.Takala-Harrison S et al. (2015) Independent emergence of artemisinin resistance mutations among Plasmodium falciparum in Southeast Asia. J Infect Dis., 211(5), 670-679. 15.Witkowski B, Amaratunga C, Khim N, et al. (2013) Novel phenotypic assays for the detection of artemisinin resistant Plasmodium falciparum malaria in Cambodia: invitro and exvivo drug response studies. Lancet Infect Dis.; 13: 1043-1049.
|
TRANG CHỦ
